茶树生长素外运载体基因CsPIN3的克隆与表达分析

从实验室前期茶树冷驯化转录组测序结果中筛选拼接得到1条与其他植物 PIN 蛋白高度相似的 EST 序列,采用反转录 PCR 结合 RACE 技术从茶树中克隆到生长素外运载体基因 PIN3的全长 cDNA 序列,命名为 CsPIN3(GenBank登录号为KP896474)。CsPIN3全长2654 bp,包含1926 bp的完整开放阅读框(ORF),编码641个氨基酸。生物信息学分析显示, CsPIN3编码的蛋白质分子量为70.15 kD,理论等电点为8.42,是一种非分泌性蛋白；亚细胞定位显示, CsPIN3主要分布于质膜上,在内质网中有少量分布,是典型的膜蛋白；氨基酸序列分析表明, CsPIN3编码蛋白由两端的疏水区和中间的亲水区构成。疏水区内有多个跨膜螺旋,其中N端疏水区有5个跨膜螺旋,C端有4个,与水稻的PIN蛋白结构相似。亲水区存在2个可变结构域,还存在着糖基化位点和磷酸化位点以及调控PIN蛋白内吞作用的NPNXY保守内在构型(inner motif, IM),如PIN蛋白特有的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶(PID/PINOID)磷酸化活性位点TPRXS(N/S)结构域；相似性及系统进化分析表明,该基因编码的氨基酸序列具有较高的保守性,与杨树、葡萄、柑橘、烟草、番茄、马铃薯、芝麻等植物的PIN序列相似性在80%以上,与茄科植物的亲缘关系最近。在拟南芥PIN蛋白中, AtPIN3与茶树CsPIN3的亲缘关系较近。组织表达特异性分析表明 CsPIN3在茶树根、茎、叶、花中均有表达,在花中的表达量较高,在茎、叶中的表达量略高于根部。实时定量PCR分析显示, CsPIN3在龙井43茶树越冬芽萌发阶段的表达量高于休眠阶段(休眠初期到膨大期之间),在茶芽萌动过程中表达上调的速度明显。推测该基因可能与茶树越冬芽休眠的维持和解除相关。