miR-15a/16-1慢病毒表达载体的构建及鉴定

目的:构建miR-15a/16-1过表达慢病毒载体,并对其进行病毒包装、鉴定、滴度测定与感染靶细胞.方法:利用PCR法钓取miR-15a/16-1序列片段;将目的基因miR-15a/16-1克隆到慢病毒载体LV3中,经双酶切及测序鉴定并大量抽提;利用脂质体将重组质粒和包装质粒pGag/Pol、pRey、pVSV-G共转染293T细胞包装产生慢病毒.收集病毒悬液梯度稀释,感染293T细胞进行病毒滴度检测;将所得慢病毒感染靶细胞.结果:酶切与测序结果证明成功构建重组质粒,并成功包装成慢病毒,实验组病毒滴度为1×109 TU/ml,对照组病毒滴度为2×109 TU/ml.慢病毒成功感染靶细胞,其转染效率可达到80％左右.结论:成功构建miR-15a/16-1慢病毒表达载体,可获得高效miR-15a/16-1的慢病毒颗粒.