PTEN过表达及其突变对活化肝星状细胞纤维状肌动蛋白的影响

目的 探讨过表达野生型第10号染色体缺失的磷酸酶张力蛋白同源物基因(PTEN)及其突变体G129E(仅保留蛋白磷酸酶活性而丧失脂质磷酸酶活性)对体外培养的活化肝星状细胞(HSC)纤维状肌动蛋白(F-actin)的影响. 方法 体外培养活化大鼠肝星状细胞(HSC-T6),用瞬时转染技术,将携带野生型PTEN基因及G129E基因的腺病毒转染活化HSC.实验分组如下:对照组:腺病毒转染时以DMEM培养基代替病毒液;Ad-GFP组:转染表达绿色荧光蛋白(GFP)的载体空病毒Ad-GFP;Ad-PTEN组:转染携带野生型PTEN基因并表达GFP的重组腺病毒Ad-PTEN;Ad-G129E组:转染携带G129E基因并表达GFP的重组腺病毒Ad-G129E.应用Western blot及实时荧光定量PCR技术检测活化HSC的PTEN蛋白及mRNA表达;借助激光扫描共聚焦显微镜(LSCM),应用荧光素四甲基异硫氰酸罗丹明(TRITC)标记的鬼笔环肽检测HSC形态、F-actin的分布及荧光强度、伪足以及应力纤维的变化,并采用钙荧光探针Rhod-2/AM负载检测HSC内钙离子(Ca2+)浓度的变化.多组间比较采用单因素方差分析,组间比较采用LSD检验. 结果 野生型PTEN基因及G129E基因在活化大鼠HSC大量表达;对照组与Ad-GFP组HSC多呈星形或多边体形,F-actin重构形成大量粗大的应力纤维,横跨于整个细胞内,细胞周围可见层状伪足;Ad-PTEN组及Ad-G 129E组HSC多为梭形,F-actin主要分布于细胞周边,细胞内可见少量纤细的应力纤维,细胞周边层状伪足消失.F-actin的荧光强度:Ad-PTEN组(357.67±13.39)及Ad-G129E组(377.25±14.55)较对照组(961.87±27.33)及Ad-GFP组(954.68±20.71)明显降低(F=1 783.486,P＜0.05);而Ad-PTEN组与Ad-G129E组、对照组与Ad-GFP组间的差异均无统计学意义(P＞ 0.05).HSC内Ca2+相对浓度:Ad-PTEN组(251.60±90.88)及Ad-G129E组(352.18±146.01)较对照组(1 953.95±132.99)及Ad-GFP组(1 937.57±115.17)明显降低(F=834.988,P＜0.05);而Ad-PTEN组与Ad-G129E组、对照组与Ad-GFP组间的差异均无统计学意义(P＞0.05). 结论 过表达的野生型PTEN及其突变体G129E可显著抑制体外活化肝星状细胞骨架蛋白F-actin的形成及细胞骨架的重构、降低了HSC内Ca2+浓度;并且,野生型PTEN的作用与其突变体G129E无明显差异.