通心络对大鼠心肌微血管内皮细胞凋亡的影响

目的 探讨通心络(Tongxinluo,TXL)对同型半胱氨酸(homocysteine,Hcy)诱导大鼠心肌微血管内皮细胞内质网应激(endoplasmic reticulum stress,ERS)致细胞凋亡的影响及其机制.方法 采用植块法原代培养大鼠心肌微血管内皮细胞,倒置显微镜观察细胞形态并通过CD31免疫荧光法对培养的大鼠心肌微血管内皮细胞进行辨别、鉴定.取2～4代生长良好的大鼠心肌微血管内皮细胞,采用免疫荧光法检测葡萄糖调节蛋白78 (glucose regulated protein 78,GRP78)表达以确定Hcy最佳作用时间.后续实验分为5组:空白对照组、Hcy诱导组(Hcy 10 mmol/L,10 h)、Hcy+TXL组(Hcy 10 mmol/L+TXL400 μg/m L)、Hcy+LY294002组(Hcy 10 mmol/L+LY294002 5μmol/L,LY294002为PI3K抑制剂)及Hcy+LY294002 +TXL组(Hcy 10 mmol/L+LY294002 5μmol/L+TXL 400 μg/mL).采用流式细胞仪检测大鼠心肌微血管内皮细胞凋亡率,实时荧光定量反转录PCR(Real-Time Reverse Transcription PCR,RT-PCR)及Western blot法检测GRP78、C/EBP同源蛋白(C/EBP homologous protein,CHOP)及天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶-12(cysteinyl aspartate specific proteinase-12,Caspase-12)mRNA及蛋白表达,Western blot法检测磷酸化磷脂酰肌醇3-激酶(phosphorylation of phosphatidylinositol 3-kinase,P-PI3K)、总磷脂酰肌醇3-激酶(total phosphatidylinositol 3-kinase,T-PI3K)、磷酸化蛋白激酶B (phosphorylation of kinase B,P-Akt)及总的蛋白激酶B(total kinase B,T-Akt)蛋白表达.结果 确定Hcy作用时间为10h.与空白对照组比较,Hcy诱导组细胞凋亡率(22.77％)升高,GRP78、CHOP和Caspase-12 mRNA及蛋白表达升高,P-PI3K和P-Akt蛋白表达降低,P-PI3K/T-PI3K及P-Akt/T-Akt降低(P ＜0.05,P＜0.01);与Hcy诱导组比较,Hcy+TXL组细胞凋亡率(10.1 7％)降低,GRP78、CHOP和Caspase-12 mRNA及蛋白表达降低,P-PI3K和P-Akt蛋白表达升高,P-PI3 K/T-PI3K及P-Akt/T-Akt升高(P ＜0.05,P＜0.01);与Hcy+TXL组比较,Hcy+TXL+LY294002组细胞凋亡率(17.9％)升高,GRP78、CHOP和Caspase-12 mRNA及蛋白表达升高,P-PI3K和P-Akt蛋白表达降低,P-PI3K/T-PI3K及P-Akt/T-Akt降低(P ＜0.05,P＜0.01).结论 通心络可抑制Hcy诱导的ERS致大鼠心肌微血管内皮细胞凋亡,其机制可能与激活PI3 K/Akt信号通路有关.