一种新的基于Red重组及I-Sec I体内切割的大肠杆菌基因组无痕删减方法

目前常用的基因修饰方法是在Red同源重组介导下,电转线性PCR片段替换染色体上指定序列.因PCR过程错误掺入,该方法常常会在同源序列部位产生一些突变.为了避免此类突变,我们建立了一种新的无痕删除方法.首先将含有抗性标记(两侧带有I-Sec I识别位点)的线性DNA电转到Red重组感受态细胞内,用抗性基因替换基因组上指定序列;然后,将携带融合同源臂(两侧带有I-Sec I位点)的供体质粒导入上述细胞,诱导表达I-Sec I内切酶切割供体质粒释放同源片段,同时切除染色体上抗性基因产生双链断裂,通过分子间同源重组实现无痕删除.我们应用该方法连续删除了大肠杆菌DH1基因组上11个非必需区,使基因组减小10.59％. PCR测序证明所有删减区域同源臂未发生突变,基因组重测序证明指定区域被删除.删减菌的生长变化不大,但耐酸能力有所改变,并对番茄红素合成有不同影响.