豆类及其制品中大肠杆菌O157和O104的双重real-time PCR检测方法

目的 建立一种快速检测豆类及其制品中肠出血性大肠杆菌O157、O104的双重real-time PCR方法.方法 分别选取大肠杆菌O157的特异性基因rfbE和大肠杆菌O104的特异性基因wzy作为靶基因,设计相应的特异性引物探针,建立双重real-time PCR反应体系,并对反应体系及引物浓度等反应条件进行优化.结果 最终确定反应体系为:以大肠杆菌O157、大肠杆菌O104菌株的DNA按照1∶3比例混合作为模板,模板DNA 2 μL,Master Mix 12.5 μL,上游引物(10 μmol/L)各1μL,下游引物(10 μmol/L)各1μL,探针(10 μmol/L)各0.5 μL,灭菌水补齐至25 μL.实现了同一次处理样品在同一反应体系中同时检测肠出血性大肠杆菌的两种血清型,检测灵敏度的下限可达102CFU/mL(g).结论 该方法特异性好,对其他常见病原菌无扩增,灵敏度高、快速、简便,为食源性致病菌的检测提供了理想手段.