低表达LATS1通过抑制Hippo信号通路促进间充质干细胞的分化增殖和迁移

目的 探讨低表达大肿瘤抑制因子1(LATS1)基因抑制Hippo信号通路对小鼠骨髓来源间充质干细胞(mMSCs)分化、增殖和迁移能力的影响.方法 将C57BL/6小鼠mMSCs分为正常对照组(MSC组)、空载体对照组(MSC-GFP组)、过表达LATS1实验组(MSC-LATS1组)、空干扰病毒转染组(MSC-shControl组)、转染干扰LATS1病毒组(MSC-shLATS1组),分别构建过表达或低表达LATS1的慢病毒载体及其空载体对照并转染mMSCs.用荧光显微镜和流式细胞仪评估慢病毒转染效率;用实时荧光定量聚合酶链反应(qRT-PCR)检测LATS1 mRNA表达,用蛋白质免疫印迹试验(Western Blot)检测LATS1、磷酸化YAP(p-YAP)、14-3-3蛋白表达,以明确LATS1对Hippo信号通路的调控作用;用茜素红、油红O染色及qRT-PCR检测成骨转录因子Runx2、OSX及成脂转录因子C/EBPα、PPAR-γ的mRNA表达,以明确Hippo信号通路对mMSCs成骨及成脂分化的影响;用四甲基偶氮唑盐(MTT)比色法检测mMSCs的数量,以评估Hippo信号通路对mMSCs增殖能力的影响;用划痕实验及Transwell小室迁移实验评估Hippo信号通路对mMSCs水平及垂直迁移能力的影响.结果 慢病毒载体转染mMSCs效率可达94.74%~96.10%.与MSC-GFP组比较,MSC-LATS1可激活Hippo信号通路〔LATS1 mRNA(2-ΔΔCT):4.37±0.21比1.20±0.04,LATS1蛋白(灰度值):2.21±0.06比1.09±0.10,p-YAP/YAP蛋白比值(灰度值):1.51±0.13比0.98±0.05,14-3-3蛋白(灰度值):1.92±0.18比1.10±0.09,均P<0.05〕,抑制mMSCs成骨及成脂分化〔钙质沉积(A值):0.13±0.02比0.40±0.03,Runx2 mRNA(2-ΔΔCT):0.51±0.02比0.98±0.09,OSX mRNA(2-ΔΔCT):0.41±0.04比1.04±0.09,脂质沉积(A值):0.10±0.02比0.25±0.03,C/EBPαmRNA(2-ΔΔCT):0.33±0.03比1.11±0.09,PPAR-γmRNA(2-ΔΔCT):0.29±0.02比1.04±0.10,均P<0.05〕,抑制4~7 d的MSC增殖及mMSCs水平和垂直迁移能力〔划痕弥合程度:(18.65±3.53)%比(40.29±1.87)%,迁移至Transwell小室膜下层的细胞数(个/MP):35.99±6.18比103.67±17.77,均P<0.05〕.与MSC-shControl组比较,MSC-shLATS1可以抑制Hippo信号通路〔LATS1 mRNA(2-ΔΔCT):0.16±0.01比0.98±0.03,LATS1蛋白(灰度值):0.38±0.03比1.04±0.07,p-YAP/YAP蛋白比值(灰度值):0.58±0.04比1.05±0.06,14-3-3蛋白(灰度值):0.14±0.02比1.02±0.09,均P<0.05〕,促进mMSCs成骨及成脂分化〔钙质沉积(A值):0.93±0.13比0.44±0.05,Runx2 mRNA(2-ΔΔCT):1.44±0.12比0.95±0.04,OSX mRNA(2-ΔΔCT):1.67±0.06比1.10±0.11,脂质沉积(A值):0.47±0.06比0.28±0.04,C/EBPαmRNA(2-ΔΔCT):3.98±0.61比0.99±0.10,PPAR-γmRNA(2-ΔΔCT):3.05±0.36比0.98±0.14,均P<0.05〕,促进3~7 d的MSC增殖及mMSCs水平和垂直迁移能力〔划痕弥合程度:(80.18±6.98)%比(46.18±1.01)%,迁移至Transwell小室膜下层的细胞数(个/MP):212.69±41.21比115.87±35.15,均P<0.05〕.结论 低表达LATS1可通过抑制Hippo信号通路促进小鼠mMSCs的成骨及成脂分化,增强其增殖和迁移能力.