活细胞内人AGTR1-3'UTR的荧光标记及应激定位分析

利用噬菌体衣壳蛋白MS2和带有序列特异性茎环结构(含有MS2蛋白结合位点)的RNA 之间的高度亲和力,对外源性人血管紧张素1型受体(angiotensinⅡreceptor type 1,AGTR1) mRNA3′端非翻译区(3'untranslated region,3 'UTR)片段进行红色荧光标记,进而在活细胞(HeLa)内研究该mRNA片段的应激生物学行为.通过在pSG5空载体质粒上先后插入两个双链DNA目的片段AGTR1-3'UTR和24×MS2,构建重组质粒pSG5/AGTRl-3'UTR/24×MS2,并将该质粒与重组质粒pERFP/MS2和pEGFP/C1-G3BP共转染入Hela细胞.荧光显微成像结果显示,AGTR1-3'UTR-24×MS2 mRNA片段能够携带具有入核信号的MS2-RFP融合蛋白离开胞核进入胞浆,而且在亚砷酸盐刺激下,红色荧光标记的AGTR1-3'UTR-24×MS2 mRNA片段可在胞浆中形成与应激蛋白G3BP-GFP共定位的颗粒.该结果表明,针对AGTR1-3 'UTR片段的MS2-RFP荧光标记系统构建成功,该荧光标记系统能有效避免假阳性的荧光信号.在细胞受到氧化应激时,AGTR1-3'UTR会被招募至胞浆中的应激颗粒结构中,启示了AGTR1-3'UTR区域对于调控AGTR1 mRNA在细胞内的应激定位具有重要作用.