日本血吸虫硫氧还蛋白-1的克隆、表达和功能分析

目的 克隆、表达日本血吸虫硫氧还蛋白-1(SjTrx-1)编码基因,测定重组SjTrx-1蛋白的酶催化活性,分析SjTrx-1基因在血吸虫不同发育阶段的转录本差异,观察其在日本血吸虫成虫体内的组织分布情况. 方法 从日本血吸虫cDNA文库中挑选SjTrx-1的基因序列,应用PCR技术对目的片段进行体外扩增,并克隆人原核表达载体pET28a,重组质粒转化E.coli BL21 (DE3)细胞,异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达,组氨酸标签亲和层析法纯化表达产物,二硫苏糖醇(DTT)/胰岛素还原法测定重组SjTrx-1蛋白的酶催化活性.纯化的重组SjTrx-1蛋白免疫新西兰白兔,以制备的免疫兔血清作为抗体,应用免疫荧光定位技术检测SjTrx-1在日本血吸虫成虫体内的分布情况.制备日本血吸虫各虫期的总RNA样品,利用RT-PCR方法扩增目的片段,分析SjTrx-1基因在各发育阶段的转录本丰度. 结果 构建了重组表达载体SjTrx-1/pET28a,在E coli中实现了重组SjTrx-1蛋白的可溶表达,其相对分子质量(Mr)约为38000,与预测的融合蛋白大小相符.经组氨酸标签亲和层析法获得纯化重组蛋白SjTrx-1,并测定了其体外的酶催化活性.虫期转录特异性分析显示,该基因在各个虫期均存在转录,其中胞蚴、童虫和成虫阶段的丰度较高,毛蚴和尾蚴中含量相对较低.荧光定位结果显示,SjTrx-1蛋白在虫体内分布广泛,且无组织特异性. 结论 SjTrx-1在日本血吸虫虫体内分布广泛,在胞蚴、童虫和成虫阶段的丰度较高.