金水缓纤方对肺纤维化大鼠肺组织内质网应激/未折叠蛋白反应通路的影响

目的 观察金水缓纤方对肺纤维化大鼠肺组织内质网应激/未折叠蛋白反应(ERS/UPR)通路的影响.方法 选择32只SPF级SD大鼠,按随机数字法分为正常对照组、模型组、金水缓纤方组与吡非尼酮组,每组 8 只.采用一次性气管内注射博来霉素(5 mg/kg)复制肺纤维化大鼠模型.于制模前 1d和制模后 28 d、42d测定大鼠肺功能;制模后 42d处死大鼠取肺部组织,行苏木素-伊红(HE)染色和Masson染色观察各组大鼠肺组织病理学改变;采用原位末端缺刻标记试验(TUNLE)测定肺组织细胞凋亡情况;采用定量比色法测定肺组织羟脯氨酸(HYP)含量;采用实时荧光定量反转录-聚合酶链反应(RT-qPCR)测定葡萄糖调节蛋白78(GRP78)、X-框结合蛋白 1(XBP-1)、CCAAT/增强子结合蛋白同源蛋白(CHOP)的mRNA表达水平;采用蛋白质免疫印迹试验(Western blotting)测定E-钙黏蛋白(E-cad)、α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)、GRP78、XBP-1、磷酸化真核细胞翻译起始因子-2α(p-eIF2α)、CHOP、Smad2/3 的蛋白表达水平.结果 与正常对照组比较,制模后 42d模型组大鼠肺功能指标潮气量(TV)、呼气峰流速(PEF)、吸气峰流速(PIF)均明显下降[TV(mL):1.55±0.24 比 2.39±0.37,PEF(mL/s):17.64±2.79 比 21.94±3.05,PIF(mL/s):18.30±3.99 比 26.95±2.09,均P＜0.05],气道狭窄指数(Penh)明显升高(0.71±0.12 比 0.52±0.05,P＜0.05);光镜观察肺组织病理学改变可见:模型组肺泡间隔增厚,肺泡和肺间质有广泛炎症细胞浸润,且胶原纤维大量沉积,肺泡炎和肺纤维化评分均明显升高[肺泡炎评分(分):2.50±0.84 比 0.17±0.41,肺纤维化评分(分):6.17±1.17 比 0.33±0.52,均P＜0.01];肺组织HYP含量、细胞凋亡指数(AI)和GRP78 mRNA、XBP-1 mRNA、CHOP mRNA及p-eIF2α、α-SMA、GRP78、XBP-1、CHOP、Smad2/3 的蛋白表达水平均明显增加[HYP(μg/g):16.98±3.58 比 11.57±2.35,AI:(24.27±2.73)％比(1.40±0.78)％,GRP78 mRNA(2-ΔΔCt):5.01±0.57 比 1.00±0.12,XBP-1 mRNA(2-ΔΔCt):2.20±0.39 比 1.00±0.25,CHOP mRNA(2-ΔΔCt):2.40±0.45 比 1.00±0.14,α-SMA/GAPDH:1.24±0.15 比0.17±0.04,GRP78/GAPDH:1.50±0.11 比 0.07±0.02,XBP-1/GAPDH:1.97±0.10 比 0.61±0.06,p-eIF2α/GAPDH:1.21±0.18 比 0.11±0.02,CHOP/GAPDH:1.32±0.15 比 0.04±0.02,Smad2/3/GAPDH:1.12±0.17比 0.19±0.12,均P＜0.01],E-cad的蛋白表达水平明显降低(E-cad/GAPDH:0.34±0.07 比 1.44±0.19,P＜0.01).与模型组比较,金水缓纤方组和吡非尼酮组TV、PEF、PIF均升高[TV(mL):2.03±0.17、2.10±0.36比 1.55±0.24,PEF(mL/s):21.84±3.43、19.25±2.06 比 17.64±2.79,PIF(mL/s):22.78±2.67、24.25±2.16比 18.30±3.99],Penh明显降低(0.58±0.10、0.58±0.11 比 0.71±0.12,均P＜0.05),肺组织病理学变化显著改善,胶原纤维有所减少,金水缓纤方组和吡非尼酮组肺泡炎和肺纤维化评分均明显降低[肺泡炎评分(分):1.50±0.55、1.33±1.03 比 2.50±0.84,肺纤维化评分:4.67±1.37、3.83±1.17 比 6.17±1.17,均P＜0.05],HYP含量、AI明显减少[HYP(μg/g):13.31±2.94、13.20±2.21 比 16.98±3.58,AI:(5.20±1.20)％、(7.43±1.79)％比(24.27±2.73)％,均P＜0.05],肺组织GRP78、XBP-1、CHOP的mRNA表达和α-SMA、GRP78、XBP-1、p-eIF2α、CHOP、Smad2/3的蛋白表达水平均降低[GRP78 mRNA(2-ΔΔCt):1.64±0.35、2.10±0.22比5.01±0.57,XBP-1 mRNA(2-ΔΔCt):1.75±0.40、1.06±0.30 比 2.20±0.39,CHOP mRNA(2-ΔΔCt):1.94±0.16、1.83±0.32 比2.40±0.45,α-SMA/GAPDH:0.46±0.14、0.48±0.23 比 1.24±0.15,GRP78/GAPDH:0.75±0.03、0.56±0.05 比1.50±0.11,XBP-1/GAPDH:1.16±0.07、0.62±0.06 比 1.97±0.10,p-eIF2α/GAPDH:0.81±0.12、0.61±0.09 比1.21±0.18,CHOP/GAPDH:0.49±0.10、0.30±0.06 比 1.32±0.15,Smad2/3/GAPDH:0.71±0.12、0.76±0.20 比1.12±0.17,均P＜0.05],E-cad的蛋白表达升高(E-cad/GAPDH:0.57±0.11、0.76±0.07 比 0.34±0.07,均P＜0.05).结论 金水缓纤方能改善肺功能,减少胶原沉积,减轻肺纤维化,其机制与其作用ERS/UPR通路抑制上皮间质转化和细胞凋亡有关.