人血管抑素AK(1-3)基因的克隆及在大肠杆菌中的表达

用6月龄大月份流产的新鲜肝脏组织为材料,提取总RNA,通过反转录得到Cdna,并以此为模板,经PCR得到人Angiostatin基因的AK(1-3)片段.将此PCR产物直接与载体Pmd18-T连接,转化大肠杆菌DH5α.经蓝白菌落筛选,PCR和酶切检测,筛选出阳性克隆,命名为Pmda,测序证明克隆序列与GenBank发表序列一致,大小为858 bp.用SalⅠ和BglⅡ酶切将该基因插入载体Pqe40,并转化宿主菌M15[Prep4].经质粒电泳PCR和酶切检测筛选阳性克隆,得到表达载体Pqea,插入基因与载体上小鼠DHFR基因重组形成嵌合基因.在30 ℃,2×YT培养基(Kan25μg/Ml+Amp200μg/Ml),2 mmol/L IPTG条件下诱导Pqea/ M15[Prep4]表达.所得菌体总蛋白经SDS-PAGE分析,结果表明,在预期的61kD处得到一条特异带,为AK(1-3)Cdna与载体固有基因DHFR-6хHis的重组蛋白表达产物.实验结果为抗肿瘤药物的研制提供了条件.