RhoA/ROCK信号通路在终板软骨细胞体外自然退变中的变化

目的 探讨RhoA/ROCK信号通路在终板软骨细胞体外自然退变中的表达变化.方法 提取大鼠终板软骨细胞并建立体外的终板软骨细胞自然退变模型,依次选取P2代细胞(空白对照组)至P5代细胞(自然退变组),以及治疗组(P5代细胞加入ROCK信号通路抑制剂Y27632组),倒置显微镜观察细胞形态,利用甲苯胺蓝染色对软骨细胞进行观察及表型鉴定.激光共聚焦显微镜检测空白对照组和自然退变组的细胞骨架变化.RT-PCR方法检测各组细胞中Ⅱ型胶原、SOX9、蛋白聚糖基因及信号通路中ROCK-1、ROCK-2基因的表达变化;免疫印迹检测ROCK-1、ROCK-2蛋白表达变化及利用试剂盒检测RhoA蛋白活性表达变化.结果 随着体外自然传代的发生终板软骨细胞表型基因表达逐渐丢失;细胞骨架在激光共聚焦显微镜观察下可见P5代终板软骨细胞较P2代细胞骨架明显变细.自然退变组(P5代)终板软骨细胞较空白对照组(P2代细胞)Ⅱ型胶原(P5/P2=0.248,P＜0.001)、蛋白多糖(P5/P2=0.172,P＜0.001)及SOX9(P5/P2 =0.499,P＜0.001)表达明显降低,RhoA/ROCK信号通路中关键基因ROCK-1(P5/P2=0.625,P＜0.001)表达降低、ROCK-2(PS/P2=2.527,P＜0.001)表达升高;而活性蛋白检测发现活性RhoA的量P5代较P2代明显增加.治疗组(P5代细胞中加入ROCK抑制剂Y27632)中抑制ROCK信号以后ROCK-1、ROCK-2表达较P5代细胞均明显降低,蛋白亦是如此.而治疗组中Ⅱ型胶原、蛋白聚糖、SOX9等基因表达则明显回升.结论 细胞体外自然传代从P2代细胞至P5代时,终板软骨细胞发生明显退变.并提示可通过调控RhoA/ROCK信号通路来保护终板软骨细胞退变.