神经酰胺参与Ⅱ型CD20抗体诱导的细胞程序性死亡

目的:探讨Ⅱ型CD20抗体诱导靶细胞程序性死亡的机制,为制备具有较强肿瘤杀伤能力的新型CD20抗体提供理论依据.方法:将淋巴瘤细胞Raji分别与Ⅰ型CD20抗体利妥昔单抗(Rituximab)和Ⅱ型CD20抗体托西莫单抗(Tositumomab)孵育后,采用磷脂酰丝氨酸V(annexin V)和碘化丙啶(propidium iodide,PI)双染,流式细胞仪比较两种抗体处理后程序性死亡细胞所占比例;在CD20抗体处理前,用工作浓度的caspase抑制剂Z-VAD-FMK (carbobenzoxy-valyl-alanyl-aspar tyl-[O-methyl]-fluoromethylketone)或伏马毒素(fumonisin B1,FB1)预处理Raji细胞,并采用流式细胞仪比较预处理组与未预处理组淋巴瘤细胞程序性死亡所占的比例.收集CD20抗体处理过的Raji细胞,应用高效液相色谱法检测不同的CD20抗体处理组间淋巴瘤细胞内神经酰胺(ceramide)的水平,并用相同方法检测FB1对Tositumomab引起淋巴瘤细胞内ceramide水平变化的抑制作用.用不同浓度的C2-Ceramide与淋巴瘤细胞进行孵育,16h后用annexin V & PI双染检测其诱导靶细胞程序性死亡的能力.结果:10μg/mL的Ⅰ型抗体Rituximab几乎不能诱导Raji细胞的程序性死亡,而相同浓度的Ⅱ型CD20抗体Tositumomab能够诱导(28.6±4.2)％的Raji细胞产生程序性死亡,两者差异有统计学意义(t=26.48,P＜0.01),这种程序性死亡不能被caspase抑制剂Z-VAD-FMK所抑制(F=3.01,P＞0.05).Tositumomab处理后能够引起Raji细胞内ceramide水平的升高(t=28.48,P＜0.01),且5～40μmol/L的C2-ceramide能够通过剂量依赖性的关系诱导Raji细胞的程序性死亡(F=2.71, P＞0.05).Ceramide合成的FB1可以显著抑制Tositumomab引起的Raji细胞内ceramide水平的升高(F=20.18,P＜0.01),进而显著抑制Tositumomab介导的程序性死亡(F=17.02,P＜0.01).结论:Ⅱ型CD20抗体Tositumomab而非Ⅰ型CD20抗体Rituximab可以通过介导靶细胞内ceramide水平的升高,诱导靶细胞的程序性死亡,这种程序性死亡与经典的caspase通路无关.