慢病毒转染胸苷磷酸化酶基因增强5'-脱氧氟尿苷抗结肠癌细胞活性

目的 探讨5’-脱氧氟尿苷(5’-DFUR)和氟尿嘧啶(5-Fu)对人结肠癌细胞株HT29和LS174T转染胸苷磷酸化酶(TP)基因前后抗癌效应的变化.方法 构建包含TP基因的慢病毒载体,转染结肠癌细胞株HT29和LS174T.传代5代后,以流式细胞术检测转染效率.免疫组织化学染色和Western blot检测转染TP基因前后HT29和LS174T细胞中TP蛋白的表达,逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)法检测细胞中TP mRNA的表达水平,四唑氮化合物法检测5’-DFUR和5-Fu对转染TP基因前后细胞株的半数抑制浓度(IC50),高效液相色谱(HPLC)法检测HT29和LS174T在细胞转染TP基因前后转化5'-DFUR为5-Fu的水平.结果 转染TP基因的HT29和LS174T细胞传代5代后,转染效率稳定在约95.0％.转染TP基因的HT29和LS174T细胞中TP表达阳性,而野生型细胞和仅转染病毒载体细胞中TP表达阴性;Westem blot结果显示,HT29和LS174T细胞中TP蛋白的表达明显增强.RT-PCR结果显示,转染TP基因的HT29和LS174T细胞中TP mRNA的相对表达水平分别为8.45 ±0.15和2 615.02±253.97,与野生型细胞比较,差异均有统计学意义(均P＜0.01).5 '-DFUR对转染TP基因的HT29-TP细胞和野生型细胞的IC50分别为(14.33±0.74) μmol/L和(707.66±5.66) μmol/L(P ＜0.05);对转染TP基因的LS174T-TP细胞和野生型细胞的IC50分别为(0.59±0.11)μmol/L和(239.20 ±21.83) μmol/L(P＜0.05).5-Fu对转染TP基因的HT29-TP细胞和野生型细胞的IC5o分别为(5.42±0.75) μmol/L和(14.19 ±0.97) μmol/L(P ＜0.05);对转染TP基因的LS 174T-TP细胞和野生型细胞的IC50分别为(4.41±0.96) μmol/L和(16.42±2.12) μmol/L(P＜0.05).转染TP基因后的HT29和LS174T细胞培养基中,则检出大量转化的5-Fu,较转染前分别增加了12.2 ～23.6倍,差异均有统计学意义(均P＜0.01).在细胞裂解液中也检出有少量5-Fu,但其水平仅相当于培养基中的0.9％ ～4.2％.结论 以慢病毒为载体将TP基因转染至人结肠癌细胞HT29和LS714T,能得到转染效率高和稳定传代的细胞株,并且2株细胞的TP蛋白和TP mRNA的表达水平明显增高.转染后在培养基中转化的5-Fu水平明显增高,使5-Fu和5’-DFUR对HT29和LS714T细胞的抗癌作用明显增强,但5’-DFUR增强效果更加明显.