稳定过表达TOX3的乳腺癌MDA-MB-231细胞系的建立

目的 构建人TOX高迁移率蛋白家族成员3(TOX3)基因慢病毒表达载体并建立稳定过表达TOX3的MDA-MB-231人乳腺癌细胞系.方法 通过全基因合成法合成TOX3基因序列片段,并进行PCR扩增.将TOX3基因克隆到pLVEF-1 a/GFP-Puro载体中,构建pLVEF-1 a/GFP-Puro-TOX3慢病毒载体.经酶切和测序鉴定后,将构建好的慢病毒载体进行病毒包装和病毒滴度检测.用获得的慢病毒液转染MDA-MB-231人乳腺癌细胞系,通过嘌呤霉素选择性培养,用荧光显微镜观察绿色荧光蛋白(GFP)的表达,采用实时定量PCR(qRT-PCR)检测MDA-MB-231细胞中TOX3 mRNA的表达,Western blot法检测MDA-MB-231细胞中TOX3蛋白的表达.结果 经酶切和测序鉴定,成功构建了pLVEF-1a/GFP-Puro和pLVEF-1 a/GFP-Puro-TOX3慢病毒表达载体,病毒包装后检测病毒滴度分别为2×108 TU/mL和1×108 TU/mL,转染MDA-MB-231细胞后,GFP表达的细胞达95％以上.与阴性对照组相比,qRT-PCR和Western blot结果显示,MDA-MB-231-TOx3细胞中TOX3的mRNA和蛋白表达水平均明显升高.结论 成功构建了TOX3慢病毒表达载体并建立了稳定过表达TOX3的MDA-MB-231细胞系.