顺铂耐药卵巢上皮性癌细胞株及其裸鼠移植瘤模型的建立及耐药特性探讨

目的：建立顺铂耐药性稳定的卵巢上皮性癌（卵巢癌）细胞株及其裸鼠移植瘤模型并探讨其耐药特性，为研究体内微环境耐药机制及逆转靶基因筛选奠定基础。方法采用体内外交叉诱导和连续体内诱导两种方法，以绿色荧光蛋白（GFP）标记的卵巢癌细胞株SKOV3/GFP分别建立两株顺铂耐药的卵巢癌细胞株SKOV3/DDPⅠ（为耐药细胞的对照）和SKOV3/DDPⅡ及其裸鼠移植瘤模型。采用四甲基偶氮唑蓝（MTT）比色法和流式细胞仪检测细胞耐药指数，流式细胞仪检测细胞凋亡率和细胞周期比例，高效液相色谱仪检测细胞内顺铂积量；透射电镜观察移植瘤组织的超微结构，实时荧光定量PCR技术检测移植瘤组织中铂类耐药相关基因--PTEN、STAT5、XIAP、BRCA1和MDR1 mRNA的表达水平。结果成功构建顺铂耐药卵巢癌细胞株SKOV3/DDPⅠ和SKOV3/DDPⅡ及其裸鼠移植瘤模型。MTT比色法和流式细胞仪检测显示，SKOV3/DDPⅡ细胞的耐药指数分别为2.83±0.12和3.82±0.19，SKOV3/DDPⅠ细胞的耐药指数分别为2.20±0.16和3.40±0.20，两种检测方法分别比较，差异均有统计学意义（P<0.05）。流式细胞仪检测显示，29.7和39.6μmol/L顺铂处理36 h后， SKOV3/DDPⅠ、SKOV3/DDPⅡ细胞的凋亡率[分别为（57.0±1.4）%、（74.4±2.3）%和（37.6±4.4）%、（50.5±3.4）%]均显著低于SKOV3/GFP细胞[（83.1±2.7）%和（87.4±4.0）%；P=0.024，P=0.001]，且SKOV3/DDPⅡ细胞的凋亡率明显低于SKOV3/DDPⅠ细胞（P=0.020）；SKOV3/DDPⅠ、SKOV3/DDPⅡ细胞G2/M期比例与顺铂处理时间（为0、12、24、36和48 h）呈正相关（R=0.800，P=0.104；R=0.915，P=0.029）。高效液相色谱仪检测显示，以9.9、19.8、29.7和39.6μmol/L的顺铂分别处理12、24、36和48 h后，SKOV3/DDPⅠ、SKOV3/DDPⅡ细胞内顺铂积量均显著低于SKOV3/GFP细胞（P<0.05）。透射电镜观察，接种SKOV3/GFP细胞的裸鼠移植瘤组织中，在腹腔内注射顺铂（为4 mg/kg）5次后，大部分细胞器降解，细胞核膜不完整；而接种SKOV3/DDPⅡ细胞的裸鼠移植瘤组织中，在腹腔内注射顺铂8次后才出现细胞器降解。实时荧光定量PCR技术检测显示，腹腔内注射顺铂8次后，接种SKOV3/DDPⅡ细胞的裸鼠移植瘤组织中PTEN mRNA的表达水平明显低于接种SKOV3/GFP细胞者（P=0.002）；STAT5、XIAP和BRCA1 mRNA的表达水平明显高于接种SKOV3/GFP细胞者（P<0.05）；而MDR1 mRNA几乎均无表达。结论本研究建立的顺铂耐药细胞株SKOV3/DDPⅡ具有稳定的耐药性。接种SKOV3/DDPⅡ细胞的裸鼠移植瘤组织过度表达BRCA1、XIAP、STAT5 mRNA，促进细胞DNA损伤修复、降低细胞凋亡、促进细胞增殖，而低表达PTEN mRNA则减弱了对细胞增殖的抑制作用，符合临床上铂类耐药细胞的耐药机制。