TGF-β3基因转染诱导滇南小耳猪BMSCs向软骨分化的初步研究

目的 观察TGF-β3基因转染滇南小耳猪BMSCs后目的基因的表达和向软骨细胞分化的作用. 方法 以血清5型重组腺病毒(recombinant adenovirus 5,rAd5)构建系统为基因载体,包装为重组腺病毒rAd5-TGF-p3,行双酶切及PCR鉴定.采集2月龄滇南小耳猪(体重12～15 kg)骨髓分离培养制备BMSCs,取第2代细胞用于实验.将实验分为3组,实验组和对照组分别用rAd5-TGF-β3、人腺病毒阴性空病毒载体转染BMSCs,以未转染的BMSCs为空白对照组.流式细胞仪检测转染效率,免疫荧光染色、Westem blot检测各组TGF-β3蛋白表达情况;培养后各时间点倒置相差显微镜观察细胞形态变化,Western blot检测各组Ⅱ型胶原蛋白表达情况. 结果 rAd5-TGF-β3重组腺病毒成功构建并转染BMSCs,在细胞内表达并迅速扩增,免疫荧光显微镜下可观察到强绿色荧光.流式细胞仪检测示转染72 h时病毒达最佳转染效果(转染效率为84.86％).免疫荧光染色示,rAd5-TGF-β3转染BMSCs 72 h,细胞质内有明显TGF-β3蛋白表达;转染后7、21 d Western blot检测示,实验组在相对分子质量为30×103处有TGF-β3阳性条带,而对照组和空白对照组均呈阴性.转染后体外培养,倒置相差显微镜下示实验组向软骨细胞分化明显.培养21 d时Western blot检测示,实验组在相对分子质量为130×103处有Ⅱ型胶原阳性条带,对照组和空白对照组均呈阴性. 结论 重组腺病毒rAd5-TGF-β3可成功转染BMSCs,TGF-β3蛋白可稳定表达,并促使BMSCs向软骨细胞方向分化,为软骨缺损修复的局部基因治疗奠定了实验基础.