双核酶自切割HCV全基因组复制子的构建及其体内外复制的特性

目的 建立可在细胞内直接启动HCV复制并且能产生感染性病毒颗粒的HCV全基因组复制子,进行HCV体内外实验研究. 方法 在HCV JFH1及JFH1/GND cDNA序列两侧分别加上核酶序列与pcDNA3.1载体构建重组质粒pcDNA3.1-RZ-JFH1和pcDNA3.1-RZ-JFH 1/GND.用重组质粒直接转染Huh7.5细胞及进行昆明小鼠尾静脉高压注射.定量实时逆转录聚合酶链反应、细胞免疫荧光染色、免疫组织化学染色和血清学检查分别检测其体内外复制的特性.结果 在16周的检测期内,从转染HCV复制子的Huh7.5细胞培养上清液中持续稳定地检测出1×106 ～3 × 106拷贝/ml的HCV RNA(非稳定转染),产生的病毒颗粒具有感染性.在尾静脉高压注射HCV复制子的昆明小鼠,检查到短暂的病毒血症,免疫组织化学染色未能发现HCV抗原阳性细胞,未检测到血清中HCV特异性抗体.结论 构建的HCV复制子在体外能长期、稳定及高效的产生感染性病毒颗粒,但体内实验未能获得预期效果,可能与HCV JFH1病毒株的特殊性有关.所建立的HCV全基因组复制子可用于HCV病毒学及抗病毒药物筛选等方面的研究.