重组结核分枝杆菌CFP10-ESAT-6融合蛋白的制备及应用研究

目的制备重组培养滤液蛋白10和6000早期分泌性抗原靶的融合蛋白(rCFP10-ESAT-6),研究其免疫学特性,评价其在结核病血清学诊断中的价值.方法用基因拼接(Gene SOEing)法扩增lhp-ESAT-6融合基因、并克隆入pQE30质粒,表达、纯化rCFP10-ESAT-6蛋白,通过Western blot分析其抗原性.建立豚鼠BCG免疫模型和结核分枝杆菌强毒株(H37Rv)感染模型,建立以融合蛋白为抗原的酶联免疫吸附测定(ELISA)法,检测豚鼠血清中的抗结核分枝杆菌抗体,并与以纯化蛋白衍生物(PPD)为抗原的ELISA法比较.结果重组质粒pQE30-CFP10-ESAT-6靶基因的测序结果与预计序列(lhp-linker-ESAT-6)完全一致.融合蛋白在DH5α菌中以可溶性非包涵体形式存在,表达量占菌体总蛋白的40%,分子质量为26 000,纯化后的蛋白纯度为98%,浓度为1.2 g/L.Western blot分析表明,融合蛋白与活动性肺结核患者血清、兔抗CFP10血清和兔抗ESAT-6血清都能发生特异性免疫反应.以10只生理盐水处理豚鼠血清的平均吸光度(A)值+2s为正常界限值,以融合蛋白为抗原,11份H37Rv感染豚鼠血清全部呈阳性反应,11份BCG免疫豚鼠血清仅1份呈阳性反应;以PPD为抗原,11份H37Rv感染豚鼠血清全部呈阳性反应,11份BCG免疫豚鼠血清也全部呈阳性反应.结论pQE30-CFP10-ESAT-6 DH5α菌能高效表达rCFP10-ESAT-6融合蛋白,该蛋白兼具CFP10和ESAT-6两种蛋白的抗原性,能特异性区分豚鼠因H37Rv感染和BCG免疫后产生的抗结核分枝杆菌抗体.本研究为rCFP10-ESAT-6融合蛋白在结核病血清学诊断中的应用奠定了基础.