同时检测人多瘤病毒和巨细胞病毒PCR技术的建立及在肾移植受者中的初步应用

建立同时检测人多瘤病毒(BKV)和巨细胞病毒(CMV)载量的实时定量荧光PCR技术(FQ-PCR),并探讨其在肾移植术后感染监测中的应用.选择BKV和CMV核酸保守性序列作为靶基因,PCR扩增靶片段与质粒pcD-NA3.1(一)连接.通过测序技术对进行克隆筛选.提取质粒并采用10倍梯度稀释(5×103～107拷贝/mL)作为BKV和CMV核酸序列的标准品,并评价其灵敏度；采用对比正常人DNA、BKV阳性质控和CMV阳性质控评价其特异性；通过对标准品DNA分别进行批内和批间各20次重复实验,以其循环阈值(Ct)的变异系数(CV)评价其精密度.对480例肾移植受者外周血样本,进行FQ-PCR检测BKV和CMV DNA拷贝数,检测FK506血药浓度,并对两者进行相关性分析.重组质粒经测序检测显示含有靶BKV和CMV核酸序列.所建立的FQ-PCR方法,其最低检测下限均为5.0×103拷贝/mL的DNA标准品.正常人DNA的BKV和CMV拷贝数检测为阴性,而阳性对照能够发现荧光值显著变化,证实为针对靶DNA的特异性扩增；重复性检测显示批内差异分别为3.44％(BKV)和2.23％ (CMV),批间差异分别为4.98％ (BKV)和3.76％ (CMV).肾移植患者CMV感染的阳性率为27.08％(130/480),明显高于BKV的阳性率(13.33％,64/480,P＜0.05),并且感染程度与免疫抑制剂FK506用量呈正相关.建立的同时检测BKV和CMV两种病毒载量的FQ-PCR方法具有快速、重复性好、灵敏的优点,可为临床监测肾移植术后病毒感染提供技术平台.