新克隆的硝基还原酶基因NOR1的表达及其产物的纯化

背景与目的:NOR1是与鼻咽癌密切相关的抑瘤/易感基因候选者之一,本实验旨在构建NOR1基因原核表达载体,在大肠杆菌中表达并纯化NOR1基因所编码的蛋白.方法:抽提人鼻咽正常组织中总RNA,利用RT-PCR扩增NOR1基因全长,经BamHⅠ、XhoⅠ双酶切后插入同样经BamHⅠ、XhoⅠ双酶切后的pGEX-4T-2质粒,构建表达载体pGEX-4T-2/NOR1重组表达质粒;转化大肠杆菌Jm105,用异丙基-β-D硫代半乳糖苷(isopropyl-thiogalactoside,IPTG)诱导pGEX-4T-2/NOR1/Jm105表达GST融合蛋白后,采用Westernblot验证,并用GST琼脂糖亲和层析柱对目的蛋白进行纯化.结果:酶切鉴定和测序验证成功地构建了NOR1基因原核表达载体,经十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(sodium dodecyl sulphate polyacrylamide gelelectrophoresis,SDS-PAGE)分析在大肠杆菌Jm105中成功诱导表达了一分子质量约为74kDa的融合蛋白;该融合蛋白存在于细菌裂解液的上清和沉淀中,Westernblot证实表达获得了成功;并利用亲和层析法获得了纯化蛋白.结论:成功获得了高效表达NOR1基因的原核表达产物,通过对该融合蛋白的纯化为它的多抗制备奠定了基础.