线粒体靶向MPG基因重组体对人非小细胞肺癌多药耐药细胞A549/DDP增殖的抑制作用

背景与目的:多药耐药是影响肺癌化疗效果的重要因素.本研究拟构建线粒体靶向人N-甲基化嘌呤DNA糖基化酶(MPG)基因真核表达载体,观察其在稳定转染的人非小细胞肺癌多药耐药细胞线粒体内的表达情况,并研究其对多药耐药细胞增殖的抑制作用.方法:应用重叠延伸剪接技术重组锰超氧化物歧化酶(MnSOD)线粒体靶向序列-MPG融合基因(mito-MPG);构建pCMV-Script/mitoMPG重组真核表达载体;脂质体将其转染至人非小细胞肺癌多药耐药细胞A549/DDP;G418筛选稳定表达的转染细胞;RT-PCR检测mito-MPG基因mRNA的表达水平;分离线粒体蛋白后应用Western blot检测MPG在线粒体内的表达水平;台盼蓝拒染法检测细胞增殖能力;流式细胞术检测细胞周期分布.结果:构建的融合基因经过DNA测序分析;构建的重组载体经限制性酶切分析及DNA测序分析证实为pCMV-Script/mito-MPG重组真核表达载体;转染pCMV-Script/mito-MPG载体组(MPG组)检测到mito-MPG mRNA的表达,转染pCMV-Script载体组(P组)及未转染组(C组)细胞内则未检测到;MPG组细胞线粒体内检测到MPG,P组及C组则未检测到;MPG组细胞增殖能力明显下降,P组及C组细胞增殖能力无明显差异,倍增时间分别为72.6h(C组)、73.5 h(P组)、98.9 h(MPG组);分裂增殖指数分别为51.3%(C组)、54.3%(P组)、26.1%(MPG组),MPG组出现亚二倍体峰.结论:成功构建了线粒体靶向人MPG基因表达载体,MPG在MnSOD线粒体靶向序列的引导下,顺利地进入了A549/DDP细胞线粒体内,并导致其增殖能力下降,部分细胞死亡.