抗肿瘤坏死因子-α单链抗体在大肠杆菌中的表达及表达条件的优化

目的 构建抗肿瘤坏死因子-α(Tumor necrosis factor-α,TNF-α)单链抗体(Single chain fragment variable,scFv)的原核高效表达体系,并优化表达条件.方法 在引物中添加编码6×His的核苷酸片段,使目的蛋白C-末端带有6×His标签.从质粒pCANTAB 5E-scFv中PCR扩增scFv基因,连接至pBV220载体,连接产物分别转化至E.coli BL21(DE3)和DH5α中,42℃诱导表达,并对诱导时间、培养基pH值和类型进行优化,Western blot分析表达产物的反应原性.结果 PCR扩增出的scFv基因片段长度约770 bp,且序列正确；重组表达质粒pBV220-scFv经酶切鉴定证明构建正确；在E.coli BL21( DE3)中可获得表达,在E.coli DH5α中不表达；表达的重组scFv相对分子质量约为28 000,以包涵体形式存在于胞浆中,表达量约占菌体总蛋白的15％,且可与抗His-Tag抗体发生特异性反应；工程菌的最佳诱导表达条件为:以E.coli BL21 (DE3)为宿主菌,在pH7.4的LB培养基中,42℃诱导5h.结论 将scFv的表达载体更换为pBV220,可提高scFv的表达量,在优化表达条件下,scFv的表达水平进一步提高.