利用Tet-Off表达系统构建鞘磷脂合酶可调控高表达的Huh7肝癌细胞

目的 利用Tet-Off表达系统构建鞘磷脂合酶(sphingomyelin synthase,SMS)可被Dox调控高表达的Huh7细胞,为进一步探讨SMS活性升高致动脉粥样硬化的机制打下基础(建立细胞模型).方法 首先将Tet-Off调控质粒转染Huh7细胞构建Huh7-tTA细胞,然后再将含外源性人SMS基因(hSMS)的PTREE2hyg质粒转染Huh7-tTA细胞,经分离纯化成功构建可调控表达hSMS的Huh7单克隆细胞(命名为SMS细胞,SMS1和SMS2).为了便于检测外源性hSMS,利用FLAG标记hSMS(SMS-FLAG).结果 SMS细胞表达SMS-FLAG受不同剂量Dox调控,SMS mRNA测定结果显示:0 ng/mL Dox剂量组较0.01 ng/mL和100 ng/mL Dox组均有显著升高(P<0.05和P<0.001);0.01 ng/mL Dox组较100 ng/mL Dox组也有显著升高(P<0.05).SMS蛋白测定结果相似于SMSmRNA结果.SMS酶活性测定结果显示0 ng/mL Dox组显著高于100 ng/mLDx组(P<0.001),而对照组(Huh7-tTA)、100 ng/mL Dox组和野生型Huh7细胞组之间差异均无统计学意义(P>0.05).结论 利用Tet-Off体系成功构建SMS高表达可调控Huh7细胞,SMS细胞SMS高表达受Dox剂量调控.