Ad-ING4-poly(A)-Promoter-IL-24双基因共表达载体构建及表达

目的 构建poly(A)-Promoter介导的携带人肿瘤生长抑制因子4(ING4)和人白细胞介素-24(IL-24)双基因的重组腺病毒共表达载体Ad-ING4-poly(A)-Promoter-IL-24(简称Ad-ING4-IL-24),研究Ad-ING4-IL-24对HepG-2人肝癌细胞生长的影响.方法 以含有poly(A)和Promoter (hEF1-eIF4g)基因片段的pORF-mbcl-2α质粒为模板,PCR扩增poly(A)-Promoter目的 片段(含Sal Ⅰ,Not Ⅰ),亚克隆至pAdTrack-CMV载体中以构建pAdTrack-CMV-poly(A)-Promoter空载体,再分别以pcDNA3.0-ING4和pcDNA3.0-IL-24重组质粒为模板,PCR扩增ING4(含BglⅡ,Sal Ⅰ)和IL-24(含XhoⅠ,XbaⅠ)目的 基因片段,并依次插入pAdTrack-CMV-poly(A)-Promoter载体中构建pAdTrackCMV-ING4-Poly(A)-Promoter-IL-24双基因共表达重组转移载体,测序正确后用Pme Ⅰ酶线性化,与腺病毒骨架质粒pAdEasy-1构建同源重组腺病毒质粒pAdEasy-1-pAdTrack-CMV-ING4-poly(A)-Promoter-IL-24,再经Pac Ⅰ酶线性化后用脂质体转染QBI-293A包装细胞,经多轮扩增后收获Ad-ING4-IL-24重组腺病毒子,其效价可达3.5×109PFU/ml,用RT-PCR和Western blot法分别鉴定ING,4和IL-24基因在HepG-2人肝癌细胞中的转录和表达,MTT法和流式细胞仪检测Ad-ING4-IL-24对HepG-2人肝癌细胞生长抑制和诱导细胞凋亡的功能及其增效作用.结果 DNA测序结果显示pAdTrack-CMV转移载体中插入的ING4、poly(A)-Promoter和IL-24序列与GenBank报道的完全一致,RT-PCR和Western blot检测结果显示Ad-ING4-IL-24能成功介导ING4和IL-24基因在HepG-2人肝癌细胞中表达;并能明显抑制HepG-2人肝癌细胞的生长和诱导其凋亡,其中Ad-ING4-IL-24双基因组更优于相应各单基因组.结论 成功构建了poly(A)-Promoter介导的Ad-ING4-IL-24双基因共表达重组腺病毒载体,Ad-ING4-IL-24不仅能明显抑制HepG-2人肝癌细胞生长和诱导其凋亡,而且与Ad-ING4和AdIL-24单基因组相比具有抑癌增效作用.