含核受体真核表达载体的构建及其转染真皮多能干细胞

背景:研究表明含核受体基因在神经系统发育过程中具有重要意义,是维持成体干细胞增殖和成神经分化的关键基因.目的:拟构建含核受体真核重组表达质粒pEGFPN1-TLX,并筛选出能稳定表达含核受体的真皮多能干细胞.设计、时间及地点:细胞基因学实验,于2007-03/12在解放军第三军医大学基础医学部病原生物学教研室完成.材料:成年SD大鼠1只,由解放军第三军医大学实验动物研究所提供;真皮多能干细胞由解放军第三军医大学全军复合伤研究所分离培养;质粒载体pEGFPN1及细菌DH5α由徐文岳教授惠赠.方法:首先以大鼠的大脑组织总RNA为模板,RT-PCR扩增出含核受体的编码cDNA序列,T/A克隆至pMD18-T载体上,然后用BamHI、HindⅢ双酶切释放出经测序鉴定为阳性的重组质粒pMD18-T-TLX中的含核受体片段,亚克隆到真核载体pEGFPN1中,从而构建真核重组表达质粒pEGFPN1-TLX,最后采用阳性脂质体将pEGFPN1-TLX转染到真皮多能干细胞中.主要观察指标:转染后24 h荧光显微镜下观察绿色荧光,RT-PCR检测含核受体mRNA的表达,免疫组化染色观察向神经细胞的分化情况.结果:PCR、酶切和测序结果证明,成功地将含核受体全长cDNA克隆到pEGFPN1质粒中,并成功构建pEGFPN1-TLX重组质粒.与未转染真皮多能干细胞相比,10 d后可见pEGFPN1-TLX转染的真皮多能干细胞继续生长,并于15 d时形成抗性克隆,荧光显微镜下有绿色荧光蛋白表达;而未转染的真皮多能干细胞10 d时已全部死亡.RT-PCR结果显示,pEGFPN 1-TLX转染真皮多能干细胞表达TLXmRNA.诱导后3d与单纯真皮多能干细胞比较,pEGFPN1-TLX转染的真皮多能干细胞诱导成NF200阳性细胞数明显增加,诱导成GFAP阳性细胞数明显减少.结论:实验成功构建含核受体真核表达载体,并成功转染了真皮多能干细胞.转染后能明显提高真皮多能干细胞向神经元分化的效率,而向胶质细胞分化受到抑制.