5-IAF标记兔心肌肌钙蛋白C的荧光特性

背景: 心肌肌钙蛋白在检测心肌梗死的诊断中有极其重要的临床意义.目的: 将荧光标记物5-iodoaccetamidofluorescein(5-IAF)应用于心肌肌钙蛋白,观察其足否可用作与收缩调节蛋白之间相互作用的研究.设计、时间及地点: 随机对照实验,于2002-01/2005-12在广州医学院人体解剖教研室完成.材料: 成年兔,由广州医学院实验动物中心提供.方法: 利用反转录-聚合酶链反应技术制备兔心肌肌钙蛋白C的基因片段,应用基因重组技术将兔心肌肌钙蛋白C基因片段克隆到pET表达载体,根据PCR定点诱变的方法,取得突变型的兔cTnC(C35S),分别将5-IAF和2-(4'-(iodoacetamido)anilino)naphthalene-6sulfonic acid(IAANS)标记在兔肌钙蛋白C(C35S),并进行恒态荧光测定和时间-分辨荧光测定.主要观察指标: 兔cTnC(C35S)-IAF及cTnC(C35S)-IAANS的荧光特性.结果: 5-IAF标记的兔肌钙蛋白C在波长491 nm处进行激发,其发射峰值出现在波长520nm处,加入饱和的镁离子可导致荧光强度减少35%,继续用饱和的钙离子滴定,其荧光强度再减少35%,而且波峰向蓝光方向移动3 nm.IAANS标记的cTnC(C35S)在加进镁离子和钙离子后引起的荧光反射的跃迁,并不出现在用5-IAF标记的cTnC上.然而,不管使用哪一种荧光标记物,钙引起cTnc的构象变化这个作用并没有改变.钙滴定实验表明,两种荧光标记物标记的荧光发射结合参数是一致的.结论: 5-IAF标记可以应用于心肌肌钙蛋白与其他收缩调节蛋白之间相互作用的研究.