人β-神经生长因子和神经生长因子基因重组真核表达载体的构建

目的:人神经生长因子包括β-神经生长因子、神经生长因子这两种活性形式,拟分别构建这两种活性形式的基因重组真核表达载体,为进一步的转基因实验作好前期准备.方法:实验于2001～2004年在青岛大学医学院附属医院中心实验室完成.①对象:健康志愿者5人,均对本实验知情同意.流产胎儿由青岛大学医学院妇产科提供,产妇均签署知情同意书,实验经医院医学伦理委员会批准.②实验方法:根据人β-神经生长因子与神经生长因子的全长基因序列设计合成特异性引物.抽取正常人外周血1.5 mL,提取基因组DNA后克隆出人β-神经生长因子基因片段.取胎儿海马部位脑组织100 mg,采用RT-PCR技术从胎儿脑组织中克隆出人神经生长因子基因片段.分别将纯化的β-神经生长因子产物与神经生长因子产物连接于真核表达载体pcDNA4上,构建重组真核表达载体.转入JM109大肠杆菌中,扩增后小剂量质粒提取,酶切鉴定及计算机自动测序.结果:β-神经生长因子和神经生长因子的PCR产物琼脂糖凝胶电泳结果显示,在预期位置均有阳性条带.酶切鉴定结果及计算机自动测序均证实插入片段为目的基因片断.结论:实验分别从人外周血和胎脑海马组织中成功克隆获得β-神经生长因子与神经生长因子,并顺利构建这两种活性形式的重组真核表达载体pcDNA4-β-NGF与pcDNA4-NGF,为进一步将神经生长因子基因转入真核细胞并比较二者表达效率作好准备工作.