反义基质金属蛋白酶2基因对人增殖期血管瘤内皮细胞的影响

目的:观察Ad-aMMP-2cDNA转染原代培养的增殖期血管瘤内皮细胞后,对体外培养的血管内皮细胞生物学特性的影响.方法:实验于2003-10/2004-06在四川大学华西临床医学院肿瘤实验室,四川大学基础与法医学院电镜室完成.选用1名出生52 d女性患儿左胸壁的海绵状血管瘤(病理诊断为增殖期血管瘤)作组织块原代培养,分离、纯化并传代培养至4代后,经形态学观察、免疫组织化学染色和电镜观察鉴定确认为增殖期血管瘤内皮细胞.将血管瘤内皮细胞分3组:①M199组:继续用无血清M199培养24 h.①Ad-GFP组:用10μL Ad-GFP(MOI=100)转染每孔的细胞,1 h后追加无血清M199培养24 h.③Ad-aMMP-2组:用10μL Ad-aMMP-2cDNA(MOI=100)转染每孔的细胞,1 h后追加无血清M199培养24 h.观察Ad-aMMP-2组血管内皮细胞转染后24,48,120 h基质金属蛋白酶2 mRNA的表达.逆转录-聚合酶链反应、免疫印迹技术和明胶酶谱试验的方法检测在核酸水平和蛋白水平基质金属蛋白酶2基因的表达.结果:①组织块法原代培养的增殖期血管瘤内皮细胞:获取的第1代血管瘤内皮细胞纯度达70%,椎虫蓝染色显示成活率在95%以上.②逆转录-聚合酶链反应定量检测mRNA:Ad-aMMP-2组血管瘤内皮细胞转染Ad-aMMP-2后24 h,与同时段的Ad-GFP组比较,基质金属蛋白酶2 mRNA表达水平均开始下降0.327±0.034,0.531±0.158;48 h后下降的趋势更加明显0.189±0.028,0.505±0.083,(P＜0.05);120 h后基质金属蛋白酶2mRNA的表达显著下降0.106±0.014,0.510±0.106,(P＜0.01).③明胶酶谱试验和免疫印迹技术检测表明:Ad-GFP组血管瘤内皮细胞表达基质金属蛋白酶2与M199组无明显差异,而Ad-aMMP-2组血管瘤内皮细胞表达基质金属蛋白酶2明显低于Ad-GFP组和M199组.结论:①用组织块法原代培养增殖期血管瘤内皮细胞,能获得纯度较高的血管瘤内皮细胞.②在体外实验中,反义基质金属蛋白酶-2cDNA可以有效抑制血管瘤内皮细胞分泌基质金属蛋白酶2.