大鼠白细胞介素10复制缺陷型重组腺病毒前体质粒的构建

目的:构建含有大鼠白细胞介素10基因的重组复制缺陷型腺病毒前体质粒pAd.rIL-10,为后续病毒构建、真核表达及其动物模型研究提供实验基础.方法:实验于2005-07/2006-04在中山大学附属第一医院普通外科实验室完成.①实验材料:SD大鼠购自中山大学动物实验中心(SCXK(粤)2004-0011).AdEasy系统由美国John Hopkins肿瘤研究中心惠赠.ThermoscriptTMRT kit和Trizol为InVitrogen产品;质粒小量提取试剂盒(QIAGENE公司);PCR试剂盒、限制性内切酶HindⅢ和SaⅡ、DNA marker(大连宝生物公司);限制性内切酶Pme Ⅰ(英国NEB公司).克隆大鼠白细胞介素10基因引物合成及测序由上海博亚生物技术有限公司完成.②实验方法:采用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)方法从健康SD大鼠脾脏新鲜组织中提取的总RNA中,克隆大鼠白细胞介素10基因,采用AdEasy-1腺病毒载体系统,经两步氯化钙法通过E.ColiBJ5183细菌内同源重组而获得重组腺病毒前体质粒pAd.rIL-10.③实验评估:使用PCR、酶切及DNA测序方法证实重组质粒中的目的基因.结果:①克隆大鼠白细胞介素10基因:用RT-PCR的方法从健康SD大鼠脾脏组织提取的总RNA中扩增出大鼠白细胞介素10基因,基因两端加上了限制酶酶切位点,均经测序证实.②重组腺病毒前体质粒pAd.rIL-10的鉴定:重组转移质粒pAdTrack-CMV.rIL-10及腺病毒前体质粒pAd.rIL-10均含大鼠白细胞介素10基因,经HindⅢ和SaⅡ双酶切后均获得538bp的大鼠白细胞介素10片段.结论:采用AdEasy-1系统经两步氯化钙法成功构建出大鼠白细胞介素10重组腺病毒前体质粒,方法简便易行,结果稳定可靠.