RNA干扰体外抑制人食管鳞癌细胞Eca-109缺氧诱导因子-1α的表达

目的:观察缺氧诱导因子-1α(hypoxia inducible factor-1α,HIF-1α)短发夹状RNA(short hairpin RNA,shRNA)对人食管鳞癌细胞系Eca-109中HIF-1α基因的沉默效应,筛选有效干扰靶点.方法:设计合成干扰缺氧诱导因子-1αRNA寡核苷酸片段,经退火、连接等步骤克隆至线性化的PGCsi真核表达载体上,测序鉴定.应用LipofectamineTM 2000将该质粒分别转染Eca-109细胞和293T细胞,其中Eca-109抗性细胞又经2-4 wk的G418筛选.荧光显微镜评估转染效率,荧光定量RT-PCR检测HIF-1αmRNA表达情况,Western blot检测HIF-1α蛋白表达情况.结果:成功构建了3个靶点的重组质粒pGCsiH1-shHIF, 293T细胞平均转染效率为约85.4%,Eca-109细胞的平均转染效率约73.2%.荧光定量RT-PCR和Western blot显示瞬时转染这3种重组质粒的293T细胞和筛选2 wk的Eca-109细胞HIF-1αmRNA和蛋白表达均较对照组有不同程度的下降,其中2号和3号靶点的干扰效应尤为明显.在瞬时转染72 h后的293T细胞中,其抑制率分别达到了78.5%、86.9%(P=0.000,P=0.000 vs 72 h空白对照组),筛选2 wk的Eca-109细胞中,3号靶点对HIF-1αmRNA的抑制率也达到了69.7%(P=0.000 vs2 wk空白对照组).结论:重组质粒pGCsi-shHIF能有效抑制食管鳞癌细胞Eca-109中HIF-1α基因的表达,经不同细胞中的瞬时和稳定转染筛选出了有效干扰靶位.