人表皮生长因子基因真核表达载体的构建及其基因转染

目的:构建人表皮生长因子基因真核表达载体,并将其导入细胞中表达表皮生长因子重组蛋白.方法:经Hind Ⅲ、Bam HI酶切PGEM-T Easy-hEGF,将人表皮生长因子基因定向克隆到真核表达载体pcDNA3.1中.在脂质体的包裹下将pcDNA3.1-hEGF导入角膜组织细胞中,分别从DNA、RNA、蛋白质3个水平上检测人表皮生长因子基因表达情况.结果:经T7/SP6和hEGF内套引物进行PCR扩增及酶切鉴定重组体,分别得到310 bp和162 bp两条基因片段,将162 bp条带经纯化后用AVaⅢ限制性内切酶切鉴定,可分别得到89 bp和72 bp两条片段;将人表皮生长因子基因序列与Genbank上公布的序列相比,碱基同源性达98.2%,氨基酸完全相同;PCR,RT-PCR在转染后21 d之内,在DNA、RNA水平上可检测到人表皮生长因子基因;免疫组织化学检测法在转染后第3天可检测到人表皮生长因子蛋白表达,2周之后,人表皮生长因子蛋白表达结果转为阴性. 结论:pcDNA3.1-hEGF重组质粒与LipofectamineTM2000以适当比例混合形成的微囊可携带人表皮生长因子基因进入细胞内并表达功能蛋白.