用GAP启动子在毕节酵母中组成型表达人血管抑制素

为探索用GAP启动子(PGAP)取代AOX1启动子(PAOX1),在毕节酵母(P.pastoris)中组成型表达外源蛋白的可能性,应用PCR方法从P.pastoris染色体中扩增了GAP启动子,以其取代诱导型表达载体pPIC9K上的PAOX1,构建了组成型表达载体pGAP9K.将人血管抑制素(AS)基因重组于pGAP9K的多克隆位点,获得含AS基因的重组质粒pGAP9K-AS.转化P.pastoris GS115,对获得的高拷贝转化子P.pastoris GS115(pGAP9K-AS)进行组成型表达,同时以诱导型转化子P.pastoris GS115(pPIC9K-AS)作为对照.SDS-PAGE结果显示:组成型转化子于培养4 d后AS的表达水平已达到高峰,分泌量为58 mg/L;而诱导型转化子诱导4 d后表达的AS仅是组成型表达的70%,诱导6 d后达到高峰,表达量也只是组成型表达系统表达高峰时(4 d)的86%.CAM分析和抗癌实验结果显示:P.pastoris GS115(pGAP9K-AS)和P.pastoris GS115(pPIC9K-AS)表达的AS均具有抑制血管生成和C57BL/6J实验小鼠的B16黑色素瘤的生长,其平均瘤重抑制率分别达到90.61%和90.54%.以上结果表明,以GAP启动子构建的组成型表达系统具有发酵时间较短、表达水平较高、不用甲醇诱导、操作系统比较简单等优点,PGAP可以取代PAOX1在P.pastoris中表达AS及其他外源蛋白.