腺相关病毒介导shRNA敲减小鼠海马兴奋性氨基酸转运体3动物模型的构建

目的 构建敲减小鼠海马神经元兴奋性氨基酸转运体3(excitatory amino acid transporter 3,EAAT3)重组腺相关病毒(recombinant adeno-associated virus,rAAV)载体,建立一种小鼠海马EAAT3敲减动物模型.方法 基于SLC 1A1 (solute carrier family 1 member 1)基因mRNA序列设计4条shRNA(short hairpin RNA),将其模板DNA与酶切后的AAV-GP-1(pAAV-U6-EGFP)载体质粒连接、转化并测序鉴定得到重组质粒,将重组质粒、pHelper包装质粒和pAAV-DJ辅助质粒共同转染至AAV-293细胞包装得到rAAV;用所得rAAV侵染HT-22细胞,72 h后RT-qPCR检测SLC1A1 mRNA表达水平;36只成年C57小鼠随机分为6组,每组6只,予海马注射rAAV-shRNA-SLC1A1-2-EGFP病毒液1μL/侧,分别于注射后即刻、24h、7d、14d、21d、28 d取双侧海马组织,Western blot检测EAAT3表达水平.结果 经测序重组质粒核苷酸序列正确,包装所得病毒浓缩滴度为1×1013 TU/ml;rAAV感染HT-22细胞72 h后SLC1A1表达量明显降低且显著低于阴性对照(P＜0.01,n=3);小鼠海马注射rAAV-shRNA-SLC 1A 1-2-EGFP 7 d后EAAT3相对表达量下降(P＜0.01),注射后21 d、28 d表达进一步降低(P＜0.01).结论 成功构建介导shRNA表达的重组腺相关病毒系统,建立了一种有效的小鼠海马EAAT3敲减动物模型.