胞苷磷酸激酶基因的克隆与原核表达

目的:克隆胞苷磷酸激酶(CMPK)基因,构建携带CMPK基因的原核表达载体,诱导表达具有活性的重组CMPK融合蛋白,获得转基因工程菌。方法:利用PCR法扩增大肠杆菌基因组DNA,纯化的PCR产物链接至pMD18-T载体上,得到重组质粒pMD18-T-CMPK,转化E.coli BL21(DE3)感受态细胞,酶切鉴定;分别用BamH I和XhoI限制性内切酶双酶切重组质粒pMD18-T-CMPK和pET28a(+)表达载体,连接后,转入E.coli BL21(DE3)感受态细胞,酶切鉴定。用终浓度1 mmol/L的IPTG诱导一定时间(3、6h)后,取E.coli上清液做电泳分析。结果:所获CMPK基因全长为786 bp,编码含有262个氨基酸的蛋白,当A值为0.6~0.8时重组质粒经IPTG诱导3h后,相对分子质量约30000处出现目的蛋白条带,随着时间的延长,蛋白表达量增加不明显。结论:成功地克隆CMPK基因,表达了大肠杆菌BL21(DE3)重组CMPK融合蛋白,为胞苷磷酸激酶进一步开发和应用奠定基础。