含变链菌SBR基因的双启动子质粒pCN-SSIE的构建及其免疫原性检测

目的:构建含有编码变形链球菌致龋毒力因子SBR基因的双启动子防龋DNA疫苗pCN-SSIE,以减毒沙门菌为载体进行高效黏膜免疫。方法:通过PCR扩增编码变形链球菌表面蛋白抗原的唾液结合区段(SBR)基因和增强型绿色荧光蛋白(EGFP)基因,将SBR基因插入到双启动子表达载体pCMVnir中,在SBR基因上游和下游依次插入人工合成的tPA信号肽基因序列、核糖体内部进入位点(IRES)基因和EGFP基因,构建质粒pCN-SSIE。通过DNA测序和酶切分析证明,双启动子表达质粒pCN-SSIE构建成功后,再用该质粒转化减毒沙门菌SL3261和转染CHO细胞,检测SBR在原核细胞和真核细胞中的表达状况,最后用pCN-SSIE裸质粒通过肌内注射免疫小鼠,检测其血清中的抗SBR特异抗体。结果:DNA测序和酶切分析均证明,构建的双启动子表达质粒pCN-SSIE开放读码框架正确;质粒在原核和真核细胞中均能正常表达;在免疫小鼠的血清中检测到了高水平的抗SBR特异IgG。结论:构建成功双启动子表达质粒pCN-SSIE,在体外真核和原核细胞中均能正常表达,用其作为DNA疫苗免疫动物,可诱导明显的免疫应答。