RNA干扰沉默蛋白激酶B基因表达对血管平滑肌细胞增殖活性的影响

目的构建靶向蛋白激酶 B(PKB/Akt)基因的逆转录病毒 RNA 干扰表达载体,观察其对血管平滑肌细胞(VSMC)增殖活性的影响。方法针对大鼠 PKB/Akt 基因序列(NM_033230)设计多个短发夹环 RNA(shRNA)序列,化学合成法合成单链寡核苷酸序列,pGEM-T 载体克隆后双酶切,将 cDNA 序列插入逆转录病毒载体 pLXIN,脂质体介导转染包装细胞 PT67后获得 PKB/Akt的重组逆转录病毒 RNA 干扰载体,感染血管平滑肌细胞(VSMC),Northern blot 和 Western blot 法检测 Akt 及其下游底物-核糖体蛋白 S6激酶(p70s6k)等表达的变化,流式细胞仪检测 VSMC 细胞周期的变化,噻唑盐(MTT)比色法检测 VSMC 增殖活性的改变。结果 shRNA 序列经 T 载体克隆,酶切确定该片段为 PKB/Akt 基因 shRNA 序列;感染 VSMC,证实其能够显著抑制 PKB/Akt 的 mR-NA 和蛋白产物表达,下游的 p70s6k 表达相应减少;被感染 VSMC 的分裂、增殖过程受阻,更多细胞停滞在 Go/G_1期。结论成功构建 PKB/Akt 基因逆转录病毒 shRNA 载体,感染 VSMC 能够明显抑制其分裂、分化和增殖。