罗氏沼虾诺达病毒套式RT-PCR检测方法的建立及初步应用

罗氏沼虾诺达病毒(Macrobrachium rosenbergii nodavirus,MrNV)是世界动物卫生组织规定必需上报的罗氏沼虾白尾病(whitetail disease,WTD)的主要病原体。为建立快速检测MrNV的套式RT-PCR方法,根据GenBank上发表的MrNV衣壳蛋白基因序列设计2对特异性引物,对PCR条件进行优化后通过特异性试验和敏感性试验检测其特异性和敏感性。结果表明:该方法能特异性地扩增出205 bp的MrNV衣壳蛋白基因片段,最佳引物浓度为0.8μmol/L、退火温度为56℃、Mg2+浓度为2.0 mmol/L,而对其他对虾病毒基因组均没有扩增出条带;检测MrNV的灵敏度大约为RT-PCR的103倍,最低可检测到2.612×10-2 fg MrNV RNA。应用套式RT-PCR和一步法RT-PCR同时对108份来自广西各地的罗氏沼虾临床样品进行检测,其中套式RT-PCR共有9份检出MrNV,而一步法RT-PCR仅有3份检出MrNV。由此可见,建立的套式RT-PCR检测方法具有极高的特异性和敏感性,能提高MrNV的阳性检出率,可用于MrNV急性感染和隐性感染的早期诊断,为WTD的临床检测、流行病学调查、进出口检疫和实验室研究提供可靠的技术手段。研究亮点:根据GenBank上发表的MrNV衣壳蛋白基因序列设计2对特异性引物,优化建立了检测MrNV的套式RT-PCR方法。该方法具有极高的特异性和敏感性,最低可检测到2.612×10-2fg MrNV RNA,能提高临床样品MrNV的阳性检出率,可用于MrNV急性感染和隐性感染的早期诊断。