Red系统三种蛋白在哺乳动物细胞核中定位表达的设计和构建

目的:构建在哺乳动物细胞核中同时定位表达Red系统三种蛋白的载体。方法:通过给red基因(gam、bet和exo)的3,端分别加入由7个氨基(pro-lys-lys-lys-Arg-Lys-val)组成的核定位信号序列(nuclear localization signal,NLS)和4个甘氨酸构成的linker序列,再从λ噬菌体基因组中,通过PCR技术分别扩增到C端均都带有NLS的gam、bet和exo的DNA全长序列,将三种PCR产物依次克隆入真核表达载体pIRES2-EGFP中,得到含3个目的基因(gam-NLS、bet-NLs和exo-NLS)的三顺反子表达载体pCMV-gNIbNIxN,转染培养的哺乳类细胞后,用作者制备并纯化的抗Red3种蛋白的抗体进行间接免疫荧光检测,观察蛋白的定位情况。结果:不带有NLS的Red3种蛋白在细胞中表达主要集中在细胞质很少进入细胞核;而带有NLS的Red3种蛋白于不同时间转染人和鼠的两种细胞后,均表达定位于细胞核中。结论:三顺反子表达载体pCMV-gNIbNIxN的成功构建为进一步探索将λ噬菌体的red系统用于哺乳动物细胞的基因替代打下基础。