pGC-silencer-U6/Neo/GFP/ABCG2真核表达质粒的构建及鉴定

目的:构建靶向人ABCG2基因的pGC-silencer-U6/Neo/GFP/ABCG2真核表达质粒,运用RNA干扰下调ABCG2基因在鼻咽癌细胞系CNE-2中的表达,并筛选出其基因沉默效果最明显的shRNA质粒表达载体。方法:针对ABCG2基因的mRNA序列设计3个干扰靶点,分别构建3个shRNA质粒表达载体和1个阴性对照质粒表达载体,经大肠杆菌扩增,酶切、PCR、测序鉴定,用脂质体法转染鼻咽癌CNE-2细胞,用real-timePCR和Westernblot检测ABCG2基因在mRNA和蛋白水平的抑制效果。结果:经测序证实,成功构建pGC-silencer-U6/Neo/GFP/ABCG2真核表达质粒。重组质粒转染CNE-2细胞后,ABCG2基因的mRNA水平及蛋白表达水平明显下调,其中以1号重组质粒效应最强,mRNA水平下调75%,蛋白水平下调68%。结论:成功构建以人ABCG2为靶向的pGC-silencer-U6/Neo/GFP/ABCG2的重组质粒。其对鼻咽癌CNE-2细胞中AB-CG2的表达具有显著抑制效应,为进一步研究ABCG2在CNE-2细胞中的功能和鼻咽癌的基因治疗奠定了基础。