体外诱导家猪骨髓间充质干细胞向成骨细胞分化

目的 观察家猪骨髓间充质干细胞(marrow mesenchymal stem cells,MSCs)在体外诱导条件下成骨分化的特征及相关基因的表达.方法 选取3月龄雌性长白猪6头,无菌条件下于胫骨近端抽取骨髓15 ml.采用密度梯度离心法并根据细胞贴壁特性对MSCs进行分离、纯化,倒置相差显微镜观察原代细胞生长情况,于培养第7天计算MSCs百分比含量及群体倍增值.将第1代细胞置于含1×10-8 mmol/L地塞米松(dexamethasone,Dex)、10 mmol/L β-磷酸甘油(β-glycerophosphate,β-GP)和82 μg/ml抗坏血酸(ascorbic acid,Asc)的成骨诱导培养液中培养21 d,作为实验组;DMEM培养液中培养作为对照组.分别行细胞形态学观察、碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)组织化学染色、钙沉积和细胞增殖测定,采用实时定量PCR分析成骨分化的相关基因表达.结果 原代MSCs特征:培养第1天,有核细胞大部分由悬浮的圆形血源性细胞组成;第3天换液弃除非贴壁细胞,MSCs克隆开始形成,细胞呈成纤维细胞样生长;第7天,镜下观察到大小不一的克隆.细胞在培养后12～14 d基本长满,原代细胞群体倍增值平均为13.MSCs成骨分化:诱导培养14 d实验组细胞形态由成纤维细胞样变成立方体样,而对照组细胞始终保持成纤维细胞样.培养5 d,对照组细胞计数为11 723±4 040,实验组为10 276±5 513,二者差异无统计学意义(P＞0.05).与对照组相比,实验组诱导培养14 d,ALP染色呈强阳性,21 d钙沉积明显增加(P＜0.01).实验组MSCs成骨相关基因:核心结合因子α1(core binding factor α1,Cbfα1)、osterix、ALP、Ⅰ型胶原、骨连接素(osteonectin,ON)、骨钙素(osteocalcin,OC)表达逐渐增强;Cbfα1、ALP、ON在分化早期增加明显;与第7天比较,第21天osterix和OC基因表达明显上调(P＜0.05);第14天,Ⅰ型胶原表达也上调(P＜0.05).结论 密度梯度离心法分离的猪MSCs,在体外诱导条件下能通过上调分化特异基因表达向成骨细胞分化.