一步法快速构建多片段连接的同源臂载体

目的:建立一种简便、高效,可一步完成多个片段连接,从而构建含同源臂的载体的方法。方法:按照酶切后可产生前后片段相匹配的粘性末端接头的原则设计PCR引物,在目的片段两端均引入BsaⅠ酶切位点。以G160基因为例,PCR扩增打靶用左右同源臂片段、示踪基因CMV-EGFP片段、载体骨架pMD19-T等4个片段,纯化后一起加入一个反应管中,并加入BsaⅠ限制性内切酶和T7DNA连接酶及相应缓冲液,进行酶切、酶连接共10~50个循环反应,一步构建含同源臂载体的质粒;产物经高温处理后,直接转化感受态细胞,并进行重组子PCR鉴定;对pMD19-T载体进行优化,突变载体上的BsaⅠ酶切位点,把示踪基因CMV-EGFP片段引入pHSG298-T载体,再选择不同的G160基因同源臂片段组合对构建系统进行验证。结果:重组质粒酶切和PCR结果表明,应用一步法可成功连接多个片段来构建含同源臂及示踪基因的克隆载体;用优化后的pMD19-T-O载体体系,在2 d内即完成了6种各含4个片段的载体的构建。结论:多个基因片段一步无缝连接的方法简便、易行、可靠,不仅可快速构建某类载体系统,还可对基因进行精确的点突变,该系统可用于快速构建基因打靶载体。