Ⅰ型鸭肝炎病毒基因组全长cDNA克隆的构建与分析

【目的】建立Ⅰ型鸭病毒性肝炎(Duck hepatitis virus,DHV)的反向遗传系统。【方法】根据Ⅰ型鸭肝炎病毒(DHV-Ⅰ)ZJ-V/2006株全基因组序列设计并合成5对特异引物,进而应用RT-PCR技术分5段扩增了DHV全基因组cDNA。将扩增的cDNA重叠片段A、B、C和DE片段分别克隆到载体pBluescriptⅡKS(+)中,获得了DHV-ⅠZJ-V/2006株全长基因组cDNA克隆pBLDHV。在扩增5′末端时,引入ApaⅠ酶切位点和SP6启动子序列;在基因组3′末段PolyA尾引入NruⅠ酶切位点,以供cDNA模板的线性化之用。【结果】核酸序列分析表明,DHV-ⅠZJ-V/2006株基因组全长为7 711个核苷酸,与DHV-ⅠZJ-V BHK-21细胞分离株的同源性为99.9%;全长基因组中有6个核苷酸发生突变,均未导致对应的氨基酸发生改变,为沉默突变。【结论】成功构建了DHV-ⅠZJ-V/2006株基因组全长cDNA。