甲型肝炎病毒病毒样颗粒的制备

目的制备甲型肝炎病毒(Hepatitis A virus,HAV)病毒样颗粒(Virus-like particles,VLPs),为研制HAV VLPs疫苗奠定基础。方法利用RT-PCR法从HAV HM175-clone4株中扩增P1-2A、P2和P3基因片段。将P1-2A和P3基因亚克隆至pFastBacDual载体,构建重组表达质粒pFastBacDual-P1-P3,转化大肠杆菌DH10BacTM,构建重组杆状病毒穿梭质粒Bacmid-P1-P3,转染昆虫细胞sf-9进行重组杆状病毒的包装。重组杆状病毒vAcP1P3扩增后,感染昆虫细胞Tn-5,培养72 h后,收获表达产物,经原位免疫荧光、EIA、Western blot法及透射电镜检测HAV VLPs的表达。表达产物经超滤及蔗糖密度梯度离心纯化。结果重组表达质粒和重组穿梭质粒分别经双酶切和PCR鉴定证明构建正确。第2、3、4代重组杆状病毒的滴度分别为1.58×105、2.13×107、3.98×107TCID50/ml。vAcP1P3转染sf-9细胞72 h后,可见HAV蛋白的表达;vAcP1P3转染Tn-5细胞后,表达的HAV抗原主要存在于沉淀中,且含量明显高于野生型杆状病毒沉淀样品(P<0.001);Wentern blot结果表明,与野生型杆状病毒组相比,HAV VLPs样品中VP3的含量相对较少,HAV VLPs样品可见相对分子质量约30 700的VP1片段及相对分子质量约27 700的VP3片段;透射电镜观察可见大小约50 nm的VLPs颗粒,略大于天然HAV颗粒。纯化的HAV蛋白主要存在于40%~50%的蔗糖梯度中,提示有VLPs形成。结论成功制备了HAV VLPs,为甲肝新型疫苗的研制奠定了基础。