脂联素对高糖刺激下内皮祖细胞的作用及其可能的作用机制

目的:研究脂联素(adiponectin,APN)对高糖刺激下内皮祖细胞(Endothelial Progenitor Cells,EPCs)的作用,并探讨其可能的机制。方法:密度梯度离心法分离人外周血单个核细胞,经含血管内皮生长因子、碱性成纤维细胞生长因子和100 ml/L胎牛血清的M199培养基培养7d,贴壁细胞进行形态学、流式细胞仪测细胞分子标志物(CD34、CD133和KDR)和激光共聚焦倒置显微镜下观察培养细胞摄取ac-LDL和结合UEA-I经何种方法鉴定为EPCs。细胞同步化后,将其随机分为7组:正常糖浓度对照组(5.5 mmol/L)、高渗对照组(5.5 mmol/L葡萄糖+24.5mmol/L甘露醇及其浓度)、高糖(30mmol/L)组及高糖APN干预组(30 mmol/L葡萄糖合并APN,1.25、2.5、5、10μg/ml)。干预48h后,分别采用MTT比色法、Transwell小室检测EPCs的增殖、迁移;以Annexin V-FITC凋亡检测试剂盒处理细胞,流式细胞仪检测EPCs的凋亡;用荧光探针(DCFH-DA)检测法进行细胞活性氧(reactive oxygen species,ROS)检测。结果:①经密度梯度离心法分离出的外周血单个核细胞培养7d后,细胞集落增加明显,梭形细胞增多并呈交叉性生长;用激光共聚焦倒置显微镜观察,细胞摄取DiI-acLDL呈红色荧光,摄取FITC-UEA-I呈绿色荧光,摄取DiI-acLDL并结合FITC-UEA-I的细胞呈黄色荧光,流式细胞仪分析结果提示:细胞表达KDR(92.32%)、CD133(10.7%)、CD34(23.3%),证实培养的细胞是正在分化的EPCs。②随着糖浓度的增高,EPCs的增殖能力下降,凋亡、ROS水平增加(P<0.01);当糖浓度为30 mmol/L与50 mmol/L时,两者相比对EPCs的影响无统计学差异。③与正常糖浓度对照组相比,高渗对照组EPCs的增殖、迁移、凋亡和ROS水平无统计学差异。在30 mmol/L葡萄糖条件下,EPCs的数量和迁移功能较正常对照组明显下降,细胞凋亡增多,不同浓度APN干预后能明显提高高糖损伤后EPCs的功能(P<0.05,P<0.01),并随着浓度的增加,EPCs的增殖与迁移能力增高,凋亡、ROS水平下降(P<0.01)。结论:①与对照组相比,高糖干预可导致EPCs增殖能力下降,细胞凋亡增多;②高糖干预后加入APN,EPCs的增殖、迁移能力恢复,细胞凋亡减少,并在一定范围内,其作用随浓度的增加而增强;③高糖可以引起EPCs功能受损,其作用机制可能与ROS水平升高有关;而APN可以通过降低高糖引起的ROS水平,保护EPCs功能;渗透压对EPCs无影响。