靶向Nrf2基因RNA干扰真核表达载体的构建

目的:利用pSUPER载体构建针对人核因子E2 p45相关因子2(Nrf2)基因的RNA干扰真核表达载体,为研究Nrf2基因在结肠癌化学预防中的作用奠定实验基础。方法:设计特异性针对Nrf2基因的寡核苷酸序列及相应的对照序列,构建重组载体pSUPER-Nrf2转染人结肠癌HT-29细胞。同时转染pEGFP-N1质粒,通过荧光显微镜观察及流式细胞仪检测绿色荧光监测转染效率,共转染pEGFP-N1 48h后G418筛选稳定表达的细胞。RT-PCR和Western blot检测瞬时及稳定转染细胞Nrf2基因的表达,观察稳定筛选出的细胞中UGT1A基因mRNA水平的表达变化。结果:成功构建RNA干扰真核表达载体pSU-PER-Nrf2。转染后24~96 h,荧光显微镜及FCM检测显示转染效率为30%~75%。瞬时转染pSUPER-Nrf2-A2,pSUPER-Nrf2-B2重组质粒Nrf2 mRNA的表达差异无显著性(P>0.05);瞬时转染72 h及稳定转染后,pSUPER-Nrf2-A1,pSUPER-Nrf2-B1可显著抑制Nrf2基因的表达。RT-PCR检测显示,稳定筛选出的细胞中UGT1A表达水平降低(P<0.05)。结论:成功构建了Nrf2的RNA干扰表达载体,筛选并获得低表达Nrf2基因的稳定克隆,筛选出的细胞UGT1A表达水平明显降低,表明Nrf2可能对UGT1A酶的表达具有调节作用。