Implication de la mutation A224D du récepteur de facteur activateur des plaquettes dans la susceptibilité à la forme rémittente de la sclérose en plaques : étude d’une population tunisienne

Résultats Une association positive du variant 224D avec la SEP rémittente a été détectée (30 % vs 48,1 %, OR [IC 95 %] = 2,04 [1,04–3,99], p = 0,023). L’exposition au risque de la SEP est en accord avec le modèle dominant (55,7 % vs 31,9 %, OR [IC 95 %] = 2,92 [1,34–6,81], p = 0,006). La mutation A224D ne présente aucun effet en considérant l’âge de début, la sévérité de la maladie et le sexe des patients. Conclusion Dans cette première étude en Tunisie, nous avons montré l’implication de la mutation A224D du récepteur de facteur activateur des plaquettes dans la susceptibilité à la forme rémittente de la sclérose en plaques. Abstract Aim of the study Platelet-activating factor interacts with its specific receptor and mediates leucocytes transmigration into central nervous system and expression of HLA molecules on antigens-presenting cells. These features are the major characteristics of multiple sclerosis pathology. In the present study, we investigated the role of platelet-activating factor receptor A224 mutation in the susceptibility to relapsing-remitting form of MS in a Tunisian population. Patients and methods Forty-seven multiple sclerosis patients and 72 healthy controls were genotyped for platelet-activating factor receptor A224D mutation using polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism technique. Results We used three models of inheritance: the codominant, dominant and recessive models. Our results showed a predisposing effect of platelet-activating factor receptor 224D variant on susceptibility to relapsing-remitting multiple sclerosis (30% vs 48.1%, OR [IC 95%] = 2.04 [1.04–3.99], P = 0.023). Our results were also consistent with a dominant model of inheritance when comparing mild genotype (AA) with carriers of one or two copies of mutant allele (AD + DD) (55.7% vs 31.9%, OR [IC 95%]= 2.92 [1.34–6.81], P = 0.006). No effect of this mutation was shown when considering the age at disease onset, disease severity or gender. Conclusion This first study reports an implication of platelet-activating factor receptor A224D mutation in the susceptibility to relapsing-remitting multiple sclerosis in Tunisian population. Further studies will be necessary to confirm the dominant role of PAFR A224D mutation and to elucidate the effect of this mutation on platelet-activating factor/platelet-activating factor receptor pathways. Mots clés Sclérose en plaques Forme rémittente PAFR A224D Polymorphisme de longueur des fragments de restriction Étude cas–témoins Keywords Multiple sclerosis Relapsing-remitting course PAFR A224D Restriction fragment length polymorphism Case-control study 1 Introduction La sclérose en plaques (SEP) est une maladie inflammatoire chronique du système nerveux central (SNC) qui touche essentiellement le jeune adulte entre 20 et 40 ans, avec une prédominance féminine [1] . Elle est caractérisée par une inflammation, l’apparition des plaques de démyélinisation et une perte progressive des axones. La formation des lésions de la SEP est un processus complexe dû à des interactions entre le système immunitaire et les antigènes de l’hôte. Ce processus inclut la migration de lymphocytes T auto-réactifs vers le SNC par l’intermédiaire de la reconnaissance de molécules d’adhésion présentes à la surface des lymphocytes T et leur réactivation en présence des auto-antigènes de la myéline. L’infiltration des leucocytes à travers la barrière hémato-encéphalique (BHE) inclue les sélectines, les intégrines, les molécules d’adhésion cellulaire, les chimiokines et les métalloprotéases matricielles [2] . Parmi les signaux déclenchant l’infiltration des leucocytes, on retrouve d’autres signaux locaux d’activation plaquettaires comme le facteur activateur des plaquettes (PAF). Le PAF (1- O -alkyl-2-acetyl- sn- glycero-3-phosphocholine) est un phospholipide biologiquement actif décrit pour la première fois par Benveniste en 1972 [3] . Il est formé par le transfert de la phosphocholine au groupement alkylacetyl- sn -glycerol grâce à l’enzyme 1- O -2-acetyl- sn -glycerolcholine phosphotransferase (CGCP) [4] . Une étude a montré que la CGCP est abondante dans le cerveau du rat et qu’elle est stimulée par des neurotransmetteurs tels que l’acétylcholine et la dopamine avec une dépendance aux ions Ca 2+ , suggérant un rôle significatif du PAF comme médiateur des blessures exo-toxiques et de la transmission synaptique [4–7] . Le PAF est produit par différents types de cellules comme les neutrophiles, les éosinophiles, les cellules microgliales et les cellules endothéliales [8] . La liaison du PAF à son récepteur spécifique platelet-activating factor receptor (PAFR) situé sur les leucocytes conduit à l’activation des intégrines des leucocytes. Ces intégrines adoptent alors leur forme à haute affinité et se fixent sur les molécules d’adhésion CAM ( cellular adhesion molecules ) entraînant le passage des leucocytes à travers la BHE [9] . Des études ont bien montré que le taux de PAF est élevé dans le liquide céphalorachidien de patients ayant une forme rémittente de la SEP [10] . Le PAF joue aussi le rôle d’un médiateur chemoattractant qui stimule les cellules inflammatoires comme les éosinophiles [11] et les polynucléaires neutrophiles [12] . Il augmente également l’expression des molécules human leucocyte antigens (HLA) de classe I et II dans quelques cellules impliquées dans la présentation de l’antigène [13] . Le récepteur du PAF (PAFR) appartient à la famille des récepteurs couplés à la protéine G [14] . Son expression a été montrée dans les neurones et les cellules microgliales [15] . Une élévation du taux des ARNm du récepteur PAFR a été aussi démontrée dans les lésions de la SEP et dans le SNC de l’encéphalite allergique expérimentale (EAE), modèle expérimental de la SEP [16,17] . Le PAFR est codé par un gène situé sur le chromosome 1p35-p34.3. Les exons 1 et 2 sont des exons 5′ non codants dirigés par deux promoteurs distincts (promoteurs de PAFR 1 et 2) ; ces deux exons présentent un épissage alternatif avec le même site accepteur sur l’exon 3 qui code pour la protéine fonctionnelle du PAFR. La mutation A224D de la protéine PAFR est une substitution d’une alanine par un acide aspartique au niveau du résidu 224 situé dans la troisième boucle cytoplasmique de la protéine [18] . Une association de la sclérose en plaques avec le variant 224D de la protéine PAFR a été rapporté par un groupe japonais [19] . Dans ce travail, nous nous proposons d’étudier le rôle de la mutation A224D de la PAFR dans la forme rémittente de la sclérose en plaques chez une population tunisienne de 45 patients et 72 individus sains. 2 Patients et méthodes 2.1 Patients et témoins Notre étude a porté sur 45 patients (moyenne d’âge 33,6 ± 10,5 ; le sexe-ratio femme : homme, 28 : 17) ayant une forme rémittente de la sclérose en plaques définie et 72 témoins non apparentés et indemnes de toutes maladies auto-immunes (moyenne d’âge 31 ± 9,0 ; le sexe-ratio femme/homme, 36 :36). Les patients ont été recrutés aux services de neurologie et de neurochirurgie à l’hôpital militaire de Tunis entre 2005 et 2008. Le diagnostic a comporté l’imagerie par résonance magnétique (IRM), l’étude des potentiels évoqués (PE) et l’analyse du liquide céphalorachidien. Seulement les formes rémittentes de la maladie ont été incluses dans ce travail. Les formes juvéniles ont été aussi écartées pour avoir un groupe de patients cliniquement plus homogène. La sévérité de la maladie a été estimée par le score EDSS (Expanded Disability Status Scale) ; la valeur moyenne est de 2,5 ± 1,4. L’âge de début de la maladie a été déterminé à la première poussée définie comme une période d’apparition ou d’aggravation assez rapide de signes ou symptômes neurologiques, durant plus de 24 à 48 heures et séparée de la précédente d’au moins un mois [20]  ; Chez nos patients, l’âge moyen de début est de 27,5 ± 10,1 ans. La durée de la maladie a été enregistrée à partir du ou des premiers signes cliniques ; la valeur moyenne est de 6 ± 6,7 ans. 2.2 Génotypage du polymorphisme platelet-activating factor receptor A224D L’extraction de l’ADN génomique des patients et des témoins a été réalisée à partir de culot lymphocytaire grâce au kit d’extraction « QIAamp ® DNA Blood Mini Kit » (QIAGEN GmbH, Hilden). Le polymorphisme PAFR A224D a été étudié par la technique de Polymerase chain reaction-Restriction fragment length polymorphism (PCR-RFLP) d’après Osoegawa et al. [19] . Les amorces utilisées pour l’amplification sont : sens-PAFR 5′ CCACAgCgCCCggCgCTTgACTgCA 3′ et antisens-PAFR 5′ ATCgTgTTCAgCTTCTTCCTggTCT 3′. Le volume final de la réaction de PCR est de 50 μl contenant 0,5 μg d’ADN génomique, 25 pmol de chaque amorce, MgCl 2 3 mM, Tampon 5 × , solution de dNTPs 200 μM et 1,5U de Taq polymérase. Le produit amplifié a été digéré avec 5U d’enzyme de restriction PstI à 37 °C pendant une nuit. Ce polymorphisme entraîne la perte d’un site de restriction ; l’allèle sauvage A est donc représenté par deux fragments de 105 et 24 pb et l’allèle muté D par un seul fragment de 129 pb ( Fig. 1 ). 2.3 Étude statistique Le logiciel utilisé pour l’analyse statistique est SPSS 16.0. L’équilibre de Hardy-Weinberg a été testé pour les deux populations de témoins et de malades. Les fréquences alléliques et génotypiques entre les deux groupes ont été comparées par le test Chi 2  avec correction de Yates et le test de Fisher pour les faibles effectifs. Le seuil de signification a été fixé à 5 %. La force d’association a été estimée par le calcul des Odds Ratio (OR) et de son intervalle de confiance à 95 %. L’effet de la mutation A224D sur l’âge de début et la sévérité de la maladie a été étudiée par le test t -Student. Nous avons testé l’association de la mutation PAFR A224D avec la SEP sous trois modèles d’hérédité : le modèle codominant, dominant et récessif. 3 Résultats 3.1 Implication du variant 224D de la protéine platelet-activating factor receptor dans la susceptibilité à la sclérose en plaques La distribution génotypique montre que les populations de malades et de témoins sont bien en équilibre de Hardy-Weinberg ( p > 0,05). La fréquence de l’allèle muté 224D (correspondant à une perte de site de restriction pour l’enzyme PstI) est de 30 % chez les malades et 17,4 % chez les témoins (OR (IC 95 %) = 2,04 (1,04–3,99), p = 0,023 < 0,05). L’allèle 224D présente un effet prédisposant sur la forme rémittente de la sclérose en plaques. Dans le modèle codominant, seul les individus hétérozygotes pour l’allèle D sont prédisposés à la maladie (55,6 % vs 29,2 %, OR (IC 95 %) = 3,07 (1,30–7,29), p = 0,004 < 0,05). Sous le modèle dominant, les patients qui portent au moins une copie de l’allèle muté (AD + DD) présente aussi un risque de développer la maladie (55,7 % vs 31,9 %, OR (IC 95 %) = 2,92 (1,34–6,81), p = 0,006 < 0,05). Le modèle récessif ne présente aucun effet du polymorphisme A224D ( Tableau 1 ). 3.2 Effet de la mutation platelet-activating factor receptor en considérant l’âge de début, la sévérité de la maladie et le sexe des patients La comparaison entre les moyennes d’âge de début de la maladie et du score EDSS chez les porteurs (AD + DD) et les non-porteurs (AA) de l’allèle muté n’a montré aucune différence significative ( p = 0,79, p = 0,63, respectivement). Chez les porteurs d’une ou de deux copies de l’allèle 224D (AD + DD), le nombre de femme est supérieur à celui des hommes mais la différence n’est pas statistiquement significative ( p = 0,91) ( Tableau 2 ). 4 Discussion Dans cette première étude dans la population tunisienne, nous nous sommes intéressés à l’étude de la mutation A224D du récepteur PAFR chez des patients tunisiens atteints d’une forme rémittente de la sclérose en plaques. Nous avons trouvé une association du variant muté 224D avec la forme rémittente de la sclérose en plaques (30 % vs 17,4 %, (OR (IC 95 %) = 2,04 (1,04–3,99), p = 0,023). Nos résultats sont en accord avec le modèle dominant ; la présence de deux copies de l’allèle muté D est nécessaire pour induire une forme rémittente de la SEP chez certains patients (55,7 % vs 31,9 %, OR (IC 95 %) = 2,92 (1,34–6,81), p = 0,006). L’effet du génotype DD sur la susceptibilité de la SEP est absent dans le modèle codominant ; cela est dû à la faible fréquence de ce génotype et aussi au faible effectif dans ce travail. Dans notre étude, aucun résultat significatif n’a été rapporté en considérant l’âge de début, la sévérité de la maladie ou le sexe des patients. Le groupe japonais de Osoegawa et al. [19] a rapporté une implication de la mutation A224D de PAFR avec la sclérose en plaques dans la population japonaise mais n’a pas trouvé d’association avec la forme rémittente de la maladie. La différence des résultats entre les deux populations peut être expliquée par la variation de la fréquence du variant PAFR 224D entre les groupes ethniques. Dans notre étude, la fréquence de ce variant chez les témoins est de 17,4 % alors qu’elle est de 6,9 % dans la population japonaise [19] . La signalisation via PAFR induit des réponses homéostatiques cellulaires mais aussi des évènements pathologiques par manque de systèmes régulateurs endogènes. Le récepteur PAFR est couplé à Gαi et Gαq. La troisième boucle cytoplasmique du PAFR a été considérée comme le siège du couplage avec la protéine G et plus spécifiquement avec les protéines Gi et Gq. Lorsque le récepteur signale via Gαi, il se produit une inhibition de l’adénylate cyclase, une diminution de l’AMPc cellulaire et une diminution de la phosphorylation des protéines. Tandis que, lorsque le récepteur signale via la protéine Gαq, il provoque l’hydrolyse du phosphatidylinositol 3,4,5-triphosphate (PIP3) en phosphatidylinositol 4,5-biphosphate (PIP2) et l’activation de la voie des phospho-inositides. Le PAF active le métabolisme des polyphosphoinositols (PPI) dans plusieurs systèmes incluant les plaquettes, les macrophages, les monocytes, les neutrophiles, les éosinophiles, les lymphocytes B, les astrocytes et d’autres types cellulaires. Cette voie d’activation est médiée par la phospholipase C (PLC), et deux produits en sont générés, l’inositol 1,4,5-triphosphate (IP3) et le diacylglycerol (DAG). L’IP3 mobilise le Ca 2+ intracellulaire et le DAG active la protéine kinase C (PKC), ce qui entraîne la libération des stocks de calcium présents dans le réticulum endoplasmique [21] . L’activation de la voie mitogen-activated protein kinase (MAPK) par le récepteur PAF entraîne l’activation des p38-MAPK engendrant une réorganisation du cytosquelette d’actine et la mobilité des leucocytes. Dans le variant PAFR 224D, l’introduction de l’acide aspartique chargé négativement modifie la conformation de l’hélice α N-terminale amphipatique, entraînant un effet direct sur la fixation du PAFR aux protéines G. Des cellules ovariennes de hamster, exprimant le mutant PAFR 224D, présentent une réduction partielle mais significative des signaux intracellulaires induits par le PAF comme la mobilisation du calcium, la production de l’inositol phosphate, l’inhibition de l’adénylate cyclase et le chimiotactisme. Ces résultats suggèrent que le variant 224D diminue la fixation du PAFR aux protéines G et pourrait être responsable de la prédisposition aux maladies ou à la variation de la réponse aux médicaments [22] . En considérant la nature pro-inflammatoire du PAF, il est inquiétant de trouver qu’une mutation qui perturbe partiellement la signalisation du PAFR soit impliquée dans la susceptibilité de la SEP. Il existe deux possibilités : • outre le rôle pro-inflammatoire du PAF, ce facteur est aussi impliqué dans l’inhibition de la production de cytokines pro-inflammatoires durant la phagocytose de cellules apoptotiques par les macrophages, probablement à travers la synthèse du facteur de croissance TGF-β [23] . Le PAF supprime aussi l’induction de l’hypersensibilité retardée et renforce la transcription du COX-2 et l’IL-10, qui sont deux médiateurs de la suppression immunitaire systémique [24] . La mutation PAFR 224D module par régulation négative les actions immunosuppressives ce qui induit la susceptibilité à la SEP chez certains patients ; • le PAF stimule préférentiellement les réponses immunitaires induites par les cellules Th2 pour produire l’IL-4 [25,26] , qui est complètement inhibé par l’antagoniste du PAFR. L’activation des cellules Th2 inhibe l’immunité relié aux cellules Th1 ; la mutation PAFR 224D peut augmenter la susceptibilité à la SEP par la régulation négative des cellules Th2. Le PAF présente aussi deux rôles différents sur les molécules d’oxyde nitrique synthéases endothéliales (eNOS). Il permet, d’une part, une stimulation de leur activation à travers le système de signalisation impliquant la phospholipase C, et d’autre part, leur internalisation dans le cytoplasme afin de réguler leurs activités [27] . L’oxyde nitrique (NO) produit par l’enzyme eNOS intervient normalement dans plusieurs fonctions physiologiques in vivo comme la néovascularisation, la régulation de la tension vasculaire, l’agrégation plaquettaire, la perméabilité vasculaire et l’interaction entre les leucocytes et l’endothélium. La mutation A224D peut diminuer la production du NO en diminuant l’activation des molécules eNOS. La réduction des taux de NO au niveau de la BHE peut activer l’adhésion des leucocytes à l’endothélium et favoriser ainsi leur infiltration à travers la BHE. 5 Conclusions Bien que sa pathogénie soit encore mal comprise, plusieurs études s’accordent à dire que la SEP se développe chez des individus génétiquement susceptibles, qui ont été en contact avec des facteurs environnementaux provocateurs. En effet, la composante génétique influence la susceptibilité à la SEP, avec l’imputabilité de très nombreux loci ayant de faibles effets lorsqu’ils sont pris dans leur individualité. Dans ce travail, nous avons étudié l’implication de la mutation A224D du PAFR et nous avons trouvé que les porteurs d’une ou de deux copies de l’allèle muté sont exposés au risque du développement d’une forme rémittente de la SEP dans la population Tunisienne. Le rôle dominant attribué à la mutation PAFR A224D doit être confirmé sur des cohortes de taille plus importante. Les conséquences de cette mutation sur les signaux émis par le système PAF/PAFR doivent être aussi bien investies. Déclaration d’intérêts Les auteurs déclarent ne pas avoir de conflits d’intérêts en relation avec cet article. Remerciements Je tiens à remercier les patients d’avoir accepter de faire partie de ce travail. Références [1] B.G. Weinshenker The natural history of multiple sclerosis: update 1998 Semin Neurol 18 3 1998 301 307 [2] Lodish H, Berk A, Matsudaira P, Darnell J, Kaiser CA, Masson PL, eds. Biologie moléculaire de la cellule, Chapitre 6 : organisation des cellules en tissus. 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