内切葡聚糖酶基因在毕赤酵母中高效表达研究

在实现了内切葡聚糖酶基因在毕赤酵母中高效表达的基础上,对表达条件进行了优化研究.根据枯草芽胞杆菌(Bacillus subtilis)内切葡聚糖酶基因序列设计引物.采用PCR扩增到获得去除信号肽后约1.4kb的内切葡聚糖酶基因片段.以此片段成功地构建了pPIC-End载体.并转化至巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)GSl 15.经过MD和MM平板筛选和酶活性测定,获得了高效表达的转化子GSl15-pPIC-End I、GSl15-pPIC-EndⅧ和GSl15-pPIC-EndⅧ.在摇瓶培养条件下,酵母工程菌表达优化条件:在pH4～8条件下均能稳定表达,诱导起始OD600=5表达水平最高,甲醇诱导最佳浓度为0.5%～1.O%,于250mL以上摇瓶培养对表达有显著的促进作用.三种工程菌在优化条件后诱导培养,酶活性可达860.7、760.3和786.2 U,分别为原始菌株酶活(63.78 U)的13.5、11.9和12.3倍.SDS-PAGE分析表明.表达产物分子量约为79.82 kD,热稳定性分析表明该酶在65℃保温30 min,可保持最高酶活的80%以上.