人表皮生长因子基因转染原代角质形成细胞

目的:将带信号肽的人表皮生长因子基因转染原代成人角质形成细胞,证实细胞活性及hEGF的有效表达,为后期的皮肤修复研究打下基础。方法:先酶切验证pcDNA3.1-hEGF,后消化成人皮肤组织,以DefinedKeratinocyte-SFM(DKSFM)传代培养角质形成细胞并鉴定,脂质体转染质粒pcDNA3.1-hEGF入细胞,转基因细胞培养48h后作RT-PCR和Western-blot分析,上清分别进行放射免疫测定和MTT测定。结果:质粒pcDNA3.1-hEGF上的hEGF序列经测序证实,双酶切后获得约230bp和5.4kb条带;成人角质形成细胞体外培养可快速稳定增殖,转hEGF基因细胞经RT-PCR扩增出一条约230bp的特异性条带,Western-blot检测到hEGF表达明显升高;放射免疫法和MTT实验证实转基因细胞有稳定的hEGF蛋白分泌。结论:质粒pcDNA3.1-hEGF在脂质体介导下成功转染成人皮肤角质形成细胞,转基因细胞能分泌有生物活性的EGF;体外培养的成人皮肤角质形成细胞可见少量EGF分泌。