利用RNAi技术稳定抑制ERβ表达的人成骨细胞株hFOB1.19细胞模型的建立

目的:探讨利用RNA干扰(RNA interference,RNAi)技术稳定抑制雌激素受体β(Estrogen receptorβ,ERβ)表达建立人成骨细胞株hFOB 1.19细胞模型的可行性。方法:设计3种特异性ERβ-shRNA,体外合成后将其克隆人pRNAT-H1.4/Retro逆转录病毒质粒中,并包装成逆转录病毒;ERβ-shRNA逆转录病毒瞬时感染hFOB l.19细胞后,通过流式细胞仪检测感染效率,并使用半定量RT-PCR和Western blot检测对ERβmRNA和蛋白表达的抑制效率;然后取ERβ抑制效率最高的hFOB l.19细胞,通过抗性筛选,将得到稳定感染的细胞扩大培养,再通过半定量RT-PCR和Western blot检测ERβ稳定抑制的效率;并应用MTT法检测ERβ稳定抑制后对细胞增殖的影响。结果:成功构建了3种ERβ-shRNA逆转录病毒载体;流式细胞仪检测结果显示,瞬时感染效率均高达70%以上;ERβ-shRNA-1、ERβ-shRNA-2、ERβ-shRNA-3逆转录病毒载体对hFOB l.19细胞中ERβmRNA的抑制率分别为(54.56±0.95)%、(69.60±1.12)%、(76.49±1.15)%,蛋白的抑制率分别为(59.21±4.44)%、(78.35±2.00)%、(85.60±2.66)%(均P<0.05);成功筛选出稳定感染ERβ-shRNA-3逆转录病毒载体的hFOB l.19细胞,ERβmRNA和蛋白的抑制率分别为(83.23±2.45)%和(93.11±0.57)%(均P<0.05),MTT法检测显示ERβ稳定抑制后对细胞的增殖没有明显影响(P>0.05)。结论:利用RNAi技术可成功建立ERβ稳定抑制的hFOB l.19细胞模型。